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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
MicroRNAs (miRNAs) have been studied regarding their biological role in gene
expression regulation at post-transcriptional level, envisioning the establishment of new
treatment strategies. Pre-miRNA-29 is the precursor form of microRNA-29, a small noncoding RNA that plays an important role in gene silencing, and proved to be involved in
several cellular mechanisms, namely in neurodegenerative diseases. To consider the
therapeutic application, efficient, and economically feasible manufacturing processes are
required for obtaining these biopharmaceuticals, assuring their integrity, purity,
stability, and bioactivity. Thus, in this work it is proposed an alternative purification
method using Ionic Liquids (ILs)-based chromatographic supports. ILs are described as
ionic compounds that present a melting point below 100 °C and are normally composed
of large and asymmetric organic cations and organic or inorganic anions. These types of
compounds can be tailored in terms of their properties, such as polarity, density, and
viscosity to achieve their effectiveness regarding the purification and stabilization of
nucleic acids. The application of Supported ILs (SILs) in RNA purification is highly
innovative and can lead to the establishment of advantageous purification methods.
Herein, the SIL under study resulted from the functionalization of silica with the 1-(3-
aminopropyl)imidazole chloride, which was named as SilPrImPrACl. First, a screening
of the best experimental conditions, in terms of pH and ionic strength, to promote
binding and elution of RNA was carried out. Moreover, in order to develop an
Experimental Design, key factors were optimized at 3 levels, using the Central Composite
Design (CCD) as model. The statistical analysis of the results showed that this model was
not the best fit for the optimization of the purification of pre-miRNA-29b, however
further analysis was carried out in order to understand the influence of the factors
studied in the recovery, purification factor and removal of impurities. Thus, it was
possible to establish some conditions conducting to a recovery and purification factor of
35.1% and 1.55, respectively. Furthermore, it was verified that the process was able to
remove 78% of proteins and 70% of gDNA present in the initial sample, proving the
effectiveness of this SIL for the purification of RNA and particularly the pre-miRNA-29b.
Os microRNAs (miRNAs) têm sido estudados relativamente à sua função de regulação da expressão génica a nível pós-transcricional, pensando na possibilidade de estabelecer novas estratégias de tratamento. O pré-miRNA-29 é a forma precursora do microRNA29, um pequeno RNA não codificante que desempenha um papel importante no silenciamento génico, e que está envolvido em vários mecanismos celulares, nomeadamente nas doenças neurodegenerativas. Para considerar a aplicação terapêutica, são necessários processos de produção eficientes e economicamente viáveis para obter estes biofármacos, assegurando a sua integridade, pureza, estabilidade e bioatividade. Assim, neste trabalho é proposto um método de purificação utilizando suportes cromatográficos à base de Líquidos Iónicos (ILs). Os ILs são descritos como compostos iónicos que apresentam um ponto de fusão inferior a 100 °C, e são normalmente compostos por catiões orgânicos e assimétricos e de aniões orgânicos ou inorgânicos. Estes compostos podem ser selecionados e desenhados de acordo com as suas propriedades, tais como polaridade, densidade e viscosidade para alcançar uma maior eficácia no que diz respeito à sua aplicação na purificação e estabilização dos ácidos nucleicos. A aplicação de líquidos iónicos suportados (SILs) na purificação do RNA é altamente inovadora e pode levar ao estabelecimento de métodos de purificação vantajosos. Neste trabalho, o SIL estudado resultou da modificação de sílica com o cloreto de 1-(3- aminopropil)imidazol, sendo denominado SilPrImPrACl. Inicialmente, foi realizado um estudo das melhores condições experimentais, em termos de pH e força iónica, para promover a ligação e eluição do RNA. Além disso, com o objetivo de desenvolver um desenho experimental, foram otimizados fatores-chave a 3 níveis, sendo eles a massa injetada de RNA, a concentração de NaCl no passo de ligação, e a concentração de NaCl no passo de eluição, utilizando o Central Composite Design (CCD) como modelo. A análise estatística dos resultados mostrou que este modelo não era o mais adequado para a otimização da purificação do pré-miRNA-29b, no entanto, foram efetuadas análises adicionais para compreender a influência dos fatores estudados na recuperação, fator de purificação e remoção de impurezas. Assim, foi possível estabelecer algumas condições que levaram a uma recuperação relativa de 35,1% e um fator de purificação de 1,55. Além disso, relativamente aos níveis de impurezas, verificou-se que o processo foi capaz de remover 78% das proteínas e 70% do gDNA presente na amostra inicial, provando a eficácia deste SIL para a purificação do RNA e particularmente do pré-miRNA-29b.
Os microRNAs (miRNAs) têm sido estudados relativamente à sua função de regulação da expressão génica a nível pós-transcricional, pensando na possibilidade de estabelecer novas estratégias de tratamento. O pré-miRNA-29 é a forma precursora do microRNA29, um pequeno RNA não codificante que desempenha um papel importante no silenciamento génico, e que está envolvido em vários mecanismos celulares, nomeadamente nas doenças neurodegenerativas. Para considerar a aplicação terapêutica, são necessários processos de produção eficientes e economicamente viáveis para obter estes biofármacos, assegurando a sua integridade, pureza, estabilidade e bioatividade. Assim, neste trabalho é proposto um método de purificação utilizando suportes cromatográficos à base de Líquidos Iónicos (ILs). Os ILs são descritos como compostos iónicos que apresentam um ponto de fusão inferior a 100 °C, e são normalmente compostos por catiões orgânicos e assimétricos e de aniões orgânicos ou inorgânicos. Estes compostos podem ser selecionados e desenhados de acordo com as suas propriedades, tais como polaridade, densidade e viscosidade para alcançar uma maior eficácia no que diz respeito à sua aplicação na purificação e estabilização dos ácidos nucleicos. A aplicação de líquidos iónicos suportados (SILs) na purificação do RNA é altamente inovadora e pode levar ao estabelecimento de métodos de purificação vantajosos. Neste trabalho, o SIL estudado resultou da modificação de sílica com o cloreto de 1-(3- aminopropil)imidazol, sendo denominado SilPrImPrACl. Inicialmente, foi realizado um estudo das melhores condições experimentais, em termos de pH e força iónica, para promover a ligação e eluição do RNA. Além disso, com o objetivo de desenvolver um desenho experimental, foram otimizados fatores-chave a 3 níveis, sendo eles a massa injetada de RNA, a concentração de NaCl no passo de ligação, e a concentração de NaCl no passo de eluição, utilizando o Central Composite Design (CCD) como modelo. A análise estatística dos resultados mostrou que este modelo não era o mais adequado para a otimização da purificação do pré-miRNA-29b, no entanto, foram efetuadas análises adicionais para compreender a influência dos fatores estudados na recuperação, fator de purificação e remoção de impurezas. Assim, foi possível estabelecer algumas condições que levaram a uma recuperação relativa de 35,1% e um fator de purificação de 1,55. Além disso, relativamente aos níveis de impurezas, verificou-se que o processo foi capaz de remover 78% das proteínas e 70% do gDNA presente na amostra inicial, provando a eficácia deste SIL para a purificação do RNA e particularmente do pré-miRNA-29b.
Description
Keywords
Desenho
Experimental Líquidos Iónicos Suportados Pre-Mirna-29b Processos de Purificação