FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento
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- Development and validation of a method for the determination of cocaine and its metabolites in hair using QuEChERS and GC- MS/MSPublication . Brito, Hugo Bernardo Marques Antunes de; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Pires, Bruno Miguel Pinheiro; Rosado, Tiago Alexandre PiresCocaine (COC) is one of the most widely consumed illicit stimulants worldwide, with a high addictive potential and severe toxicological effects. Hair analysis offers unique advantages in forensic toxicology, as it allows the documentation of chronic use and, in some cases, acute exposure. In this study, a miniaturised version of the QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Rugged, and Safe) extraction method was developed for the determination of COC and its major metabolites — anhydroecgonine methyl ester (AEME), ecgonine methyl ester (EME), cocaethylene (COET), benzoylecgonine (BEG), and norcocaine (NCOC) — in hair samples. The procedure involved 3 mL of formic acid (5%) in acetonitrile (ACN) and 625 mg of NH4HCO2 as solvent and partitioning salt, respectively, followed by a dispersive solidphase extraction (d-SPE) step using 175 mg of MgSO4 and 55 mg of primary secondary amine (PSA). Samples were analysed by gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Following optimisation through design of experiments (DoE), the method was validated according to the guidelines of the Society of Hair Testing (SOHT). The working range was set at 0.05–5 ng/mg for all analytes, except AEME (0.5–5 ng/mg). Recoveries ranged from 20–29% (AEME), 24–27% (EME), 33–42% (COC), 43–77% (COET), 25– 48% (BEG), and 27–37% (NCOC). The method was successfully applied to authentic hair samples, in which COC was detected in almost all cases, often accompanied by metabolites at concentrations above the lowest limit of quantification (LLOQ). The µ-QuEChERS method proved to be a sustainable, sensitive, and multi-analytical approach for the determination of cocaine and metabolites in hair, with strong potential for application in clinical and forensic toxicology.
- Otimização do bioprocesso de obtenção da vacina de DNA minicircular contra o cancro do colo do úteroPublication . Ferreira, Beatriz Morais; Costa, Matilde Bogalheiro; Sousa, Ângela Maria Almeida deO cancro do colo do útero é um dos tumores mais prevalentes entre as mulheres a nível mundial, estando maioritariamente associado à infeção persistente pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV), sobretudo pelos genótipos de alto risco HPV-16 e HPV-18. Nestes casos, as oncoproteínas virais E6 e E7 desempenham um papel central na transformação maligna, ao promoverem a degradação das proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respetivamente. As vacinas de DNA têm emergido como uma estratégia promissora para a prevenção e tratamento de diversas doenças infeciosas e oncológicas. Esta abordagem baseia-se na introdução de DNA exógeno em células hospedeiras, com o objetivo de induzir a expressão de antigénios específicos capazes de desencadear uma resposta imunitária preventiva e terapêutica. Entre os vetores não virais utilizados, o DNA plasmídico (pDNA) tem sido o mais explorado, devido o seu baixo custo e facilidade de produção. No entanto, a presença de elementos bacterianos, como genes de resistência a antibióticos, pode desencadear respostas imunitárias indesejadas e reduzir a segurança da sua utilização. Como alternativa, o DNA minicircular (mcDNA) constitui uma geração mais avançada de vetores, resultante de uma recombinação intramolecular do plasmídeo parental (PP) numa cultura bacteriana, que se divide em duas moléculas filhas, o miniplasmídeo (mP) (constituído somente pelos genes procariotas necessários durante o processo de produção) e o mcDNA (sendo formado exclusivamente pela cassete de expressão eucariótica). Esta característica confere-lhe vantagens significativas face ao pDNA convencional, incluindo maior segurança, menor dimensão, eficiência acrescida de transfeção, maior estabilidade intracelular e expressão génica mais duradoura, traduzindo-se num elevado potencial terapêutico. Contudo, a sua aplicação clínica requer o desenvolvimento de métodos de produção e purificação robustos, capazes de cumprir os requisitos das entidades reguladoras. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo explorar a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) como estratégia para a purificação de pDNA e mcDNA. Numa primeira fase, foram estudadas as condições de separação entre pDNA e RNA, seguindo-se a avaliação da seletividade entre mcDNA e RNA. Observou-se que o mcDNA tende a eluir em fases mais precoces, o que pode estar associado à sua menor hidrofobicidade relativamente ao RNA. Os ensaios de quantificação permitiram avaliar a pureza e recuperação dos vetores de DNA em função das estratégias exploradas, verificando a sua conformidade com os parâmetros definidos pelas agências reguladoras para as condições otimizadas. Contudo, não foi possível obter uma separação clara entre isoformas de DNA nem entre mcDNA e PP. Em suma, os resultados demonstram que a HIC constitui uma abordagem promissora para a purificação de mcDNA, fornecendo uma base sólida para otimizações futuras e para a consolidação deste vetor como ferramenta terapêutica de nova geração.
- Effects of Clobetasol on Human Skin Lipids: An Ex Vivo Study - Insights into barrier disruption and regenerative potentialPublication . Ramos, Ana Carolina da Silva; Oliveira, Rita Manuela Palmeira de; Paraskevopoulou, AnnaThe skin is the largest organ of the body, playing a vital role in the protection of the human organism. The stratum corneum (SC) is the outermost layer, composed of corneocytes embedded in a lipid matrix. Lipid ratio disruptions lead to an increase in water loss and a weaker skin barrier, causing different skin diseases. One of them, atopic dermatitis (AD), is a chronic inflammatory skin condition, impacting 15% to 20% of children and 1% to 3% of adults worldwide. As a common treatment for AD, glucocorticosteroids are used, but their transient efficacy and non-specific action often requires additional treatments, increasing the risks for adverse effects. In this project, the effect of glucocorticosteroids on the lipids of SC was investigated. To achieve this, donated human skin from plastic surgery (abdomen) was cultivated for 10 days, while applying topically clobetasol 0.05% in a suitable vehicle (propylene glycol:ethanol (7:3)) for 7 consecutive days. The viability of skin explants was tracked by the TTC assay. To gain a better understanding of the skin barrier and lipid alterations, the skin and the SC lipids were analysed using various methods, including transepidermal water loss measurement, infrared spectroscopy, alongside Liquid Chromatography with Mass Spectrometry. The results showed an increase in transepidermal water loss after treatment with clobetasol. In terms of skin viability, lipid composition, and lipid arrangement, the skin remained mostly stable. This demonstrates that short-term clobetasol treatment does not markedly alter the lipid composition of the SC. Overall, these findings help us understand how corticosteroids alter the skin barrier and SC lipids, and may inform future studies focused on creating safer, more targeted approaches to treating AD.
- Propriedades biológicas de óleos essenciais de plantas aromáticas: avaliação do potencial desinfetante do óleo essencial de Thymus zygis contra Listeria monocytogenesPublication . Sousa, Beatriz Fernandes; Ferreira, Susana Margarida Paraíso; Duarte, Ana Paula Coelho; Coimbra, Alexandra TeixeiraA contaminação de alimentos durante as etapas de produção e conservação, nomeadamente pelo contacto com superfícies, representa um risco significativo para a segurança dos alimentos. Esse risco é agravado pela presença de patógenos como Listeria monocytogenes, bactéria capaz de sobreviver em condições adversas e provocar listeriose. Nesse contexto, as plantas aromáticas, ricas em compostos bioativos, podem ser utilizadas frescas, secas ou na forma de óleos essenciais (OEs), apresentando propriedades bioativas relevantes, como atividade antimicrobiana. Esses OEs podem constituir alternativas naturais e seguras aos conservantes e desinfetantes químicos, contribuindo para a conservação e segurança dos alimentos. Thymus zygis é uma planta amplamente conhecida e utilizada na culinária, cujo OE apresenta atividades biológicas significativas. Considerando isto, este trabalho teve como objetivo principal investigar o potencial biológico de OEs provenientes de diversas plantas aromáticas, com atenção às suas propriedades antioxidantes, antimicrobianas e citotóxicas, bem como avaliar a eficácia do OE de T. zygis na redução de L. monocytogenes em suspensão, biofilmes, e em superfícies de aço inoxidável, visando a sua utilização como desinfetante natural. Sete OEs provenientes das plantas Murraya koenigii, Artemisia dracunculus, Carum carvi, Trigonella foenum-graecum, Zingiber officinale, Salvia lavandulifolia e Thymus mastichina, foram inicialmente avaliados quanto às suas propriedades antioxidantes, antimicrobianas e citotóxicas. Embora todos apresentassem forte atividade antioxidante, apenas o OE de T. foenum-graecum revelou baixa toxicidade para células humanas, enquanto os restantes se mostraram tóxicos e com reduzida ação antimicrobiana. Devido a estes resultados, o estudo concentrou-se no OE de T. zygis, analisando a sua eficácia como agente antimicrobiano e desinfetante. Constatou-se que tanto o OE quanto os seus compostos voláteis exerceram efeito bactericida sobre L. monocytogenes. Ensaios realizados segundo a norma EN 1276:2009 indicaram que o OE, na concentração de 2 µL/mL, apresentou atividade como desinfetante eficaz, enquanto a 1 µL/mL apenas foi eficaz em superfícies limpas, com aumento de atividade ao longo do tempo. Apesar de não atingir plenamente os critérios da norma EN 13697:2001, os resultados demonstram claramente o potencial do OE de T. zygis e dos seus compostos voláteis como agentes antimicrobianos em superfícies de contacto com alimentos, capazes de reduzir biofilmes formados por esta bactéria mesmo a baixas concentrações e em curtos períodos de exposição. Assim, pode-se concluir que OE de T. zygis demonstrou potencial para uso como desinfetante natural e agente anti-biofilme contra L. monocytogenes.
- Análise Comparativa entre os ensaios Freelite® e N-Latex® na Quantificação Sérica de Cadeias Leves Livres em doentes com Gamopatias MonoclonaisPublication . Francisco, Catarina Isabel Ribeiro Silva; Monteiro, Andreia Sofia dos Reis; Tomaz, Cândida Ascensão TeixeiraO Laboratório de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário da Cova da Beira (CHUCB), da Unidade Local de Saúde (ULS) Cova da Beira, constitui uma unidade especializada na recolha e análise de amostras biológicas com vista à obtenção de dados laboratoriais rigorosos, fundamentais para a formulação de diagnósticos e de estratégias terapêuticas. O presente trabalho descreve a atividade desenvolvida nas secções de Microbiologia, Hematologia e Imunoquímica, com especial ênfase na realização de um projeto de investigação na área da Imunoquímica. Nos últimos anos, o interesse clínico e científico relativamente às gamopatias monoclonais tem vindo a intensificar-se, refletindo a maior sensibilidade dos métodos de diagnóstico laboratorial e o aumento da sua prevalência, principalmente em populações envelhecidas. Estas patologias resultam da proliferação anómala de plasmócitos, responsáveis pela produção excessiva de imunoglobulinas monoclonais podendo manifestar-se de forma assintomática, como a Gamopatia Monoclonal de Significado Indeterminado, ou evoluir para doenças malignas, como o Mieloma Múltiplo. A sua deteção precoce e correta caracterização são fundamentais para uma adequada vigilância clínica e intervenção terapêutica atempada. Neste contexto, o presente projeto de investigação teve como objetivo a comparação analítica, dos métodos atualmente disponíveis no Laboratório de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Universitário da Cova da Beira, para a quantificação de cadeias leves livres (CLL) no soro de doentes com gamopatias monoclonais. Foram avaliados o método Freelite® (The Binding Site), que utiliza anticorpos policlonais, e o método N Latex® (Siemens), baseado em anticorpos monoclonais. O estudo incluiu, para a análise estatística, resultados da quantificação das CLL em amostras de soro de 108 doentes, dos quais 64 eram do sexo masculino e 44 do sexo feminino, entre outubro de 2024 e abril de 2025, com idades compreendidas entre os 41 e 96 anos. Os dados foram estratificados por tipo de gamopatia monoclonal (Gamopatia Monoclonal de Significado Indeterminado IgM, Gamopatia Monoclonal de Significado Indeterminado não-IgM e Mieloma Múltiplo). Para a análise estatística utilizaram-se os métodos de regressão de Passing-Bablok, o coeficiente de Spearman, método de Bland-Altman e o coeficiente kappa de Cohen. Os resultados revelaram discrepâncias analíticas relevantes entre os métodos, com situações em que os valores de CLL foram classificados como normais por um método e patológicos pelo outro. A concordância entre os métodos foi globalmente fraca, com particular destaque para o subgrupo MGUS não-IgM, que apresentou as maiores divergências, especialmente na determinação da razão κ/λ. Apesar de limitações decorrentes do tamanho amostral em alguns subgrupos, os resultados obtidos foram consistentes com a literatura, tendo em conta as diferenças metodológicas. Os resultados evidenciaram uma fraca correlação e baixa concordância entre os dois métodos, sublinhando a não intercambialidade dos mesmos, alertando para potenciais implicações clínicas no diagnóstico, monitorização e decisões terapêuticas e no seguimento de doentes com gamopatias monoclonais.
- Avaliação de novas combinações de fármacos em cancro do pulmão de não pequenas célulasPublication . Valente, Fabiana Duarte; Sousa, Ângela Maria Almeida de; Santos, Adriana Oliveira dosO cancro do pulmão de não pequenas células (CPNPC) continua a ser uma das principais causas de mortalidade oncológica, sendo a resistência adquirida aos inibidores da tirosina-quinase (TKIs) um dos maiores obstáculos à eficácia terapêutica. O osimertinib, TKI de terceira geração dirigido a mutações ativadoras do EGFR, é um exemplo de fármaco que apresenta eficácia clínica significativa, mas enfrenta limitações devido ao desenvolvimento de resistência. Paralelamente, a sinvastatina tem demonstrado, em investigação pré-clínica, propriedades antitumorais relevantes, incluindo indução de apoptose e modulação de vias de sinalização associadas à progressão tumoral. Neste contexto, a coentrega destes fármacos em lipossomas surge como uma estratégia inovadora a ser desenvolvida para aumentar a eficácia terapêutica e reduzir a toxicidade sistémica da sinvastatina. Neste estudo, foram desenvolvidas e caracterizadas formulações lipossomais contendo sinvastatina ou osimertinib. Ambas as formulações apresentaram diâmetro hidrodinâmico nanométrico (=90 nm), baixo índice de polidispersidade (PDI <0,2) e estabilidade físico-química adequada, garantindo consistência entre diferentes lotes. O método de encapsulamento revelou-se eficiente, com recuperações superiores a 80% para ambos os fármacos e eficácias de encapsulamento de aproximadamente de 100%. A avaliação da viabilidade celular revelou que a sinvastatina apresentou uma redução significativa do IC50 quando encapsulada em lipossomas (1,160 µM) comparativamente à forma livre (1,770 µM). O osimertinib mostrou uma diminuição ligeira do IC50 em lipossomas em relação à forma livre (0,02076 µM vs. 0,02569 µM). Notavelmente, a combinação dos dois fármacos induziu uma redução mais pronunciada do IC50 quando encapsulada em lipossomas (0,01562 µM) comparativamente à forma livre (0,1566 µM), evidenciando um efeito sinérgico significativo que supera a contribuição de cada fármaco isoladamente. Estes resultados sugerem que a encapsulação lipossomal potencia a eficácia antiproliferativa das combinações de sinvastatina e osimertinib na linha celular H1975. Estes resultados fornecem uma prova de conceito sólida para a utilização de lipossomas como veículos de coentrega de sinvastatina e osimertinib, evidenciando a sua aplicabilidade enquanto estratégia combinada no CPNPC. A abordagem demonstra potencial para maximizar a eficácia terapêutica, reduzir efeitos adversos e constituir uma base para futuros estudos pré-clínicos e clínicos.
- Study of the bioaccessibility, biodisponibility and cytotoxicity of Salvia divinorum: method development and in vitro evaluationPublication . Calado, Sara Agostinho; Alba, Maria Eugénia Gallardo; Duarte, Ana Paula Coelho; Pires, Bruno Miguel PinheiroSalvia divinorum is a psychoactive plant traditionally used in spiritual and medicinal contexts in Mexico, whose main active constituent is salvinorin A (SA). This diterpene exhibits a unique pharmacological profile, acting as a potent and selective agonist of the ?-opioid receptor, which distinguishes it from classical psychedelic substances. Due to these properties, the plant has attracted attention both as a recreational drug, particularly among young people in Europe and the United States, and within scientific research, given its potential therapeutic applications in the management of pain, depression, anxiety, and addiction. However, adverse effects and the absence of clear regulation raise toxicological concerns. The present study aimed to investigate the bioaccessibility and bioavailability of SA, with particular focus on absorption through the oral mucosa, one of the common routes of consumption. To this end, an in vitro model simulating the oral digestive process was developed, employing artificial saliva. Plant extraction was carried out from dried S. divinorum leaves, subjected to maceration and subsequent incubation with artificial saliva at 37 °C under agitation for 3 hours. The resulting extracts were analysed by highperformance liquid chromatography coupled to diode array detector (HPLC-DAD), confirming the presence of SA, but not its metabolite salvinorin B (SB). In parallel, human tongue carcinoma cells (UPCI:SCC154) were used to assess both permeability and cytotoxicity of the extract. The MTT assay revealed a dose- and timedependent effect, with reduced cell viability after prolonged exposures. The bioaccessibility assay further demonstrated that oral digestion markedly decreases the fraction of SA available for systemic absorption. The results confirmed that SA is effectively absorbed through the oral mucosa, accounting for the rapid and intense effects reported in the plant’s consumption. Nevertheless, a significant cytotoxic impact was also observed in cellular models, underscoring the need for caution in repeated or chronic use. From an analytical perspective, HPLC-DAD proved to be a robust technique for quantifying SA in complex matrices. In conclusion, S. divinorum combines considerable pharmacological potential with risks associated with uncontrolled use. The evidence gathered in this study highlights the need for further clinical investigations to evaluate safety and efficacy, as well as the development of formulations that could enable therapeutic applications of SA while minimising its adverse effects.
- Comparison of the expression of taste receptors in human brain tumor samplesPublication . Soares, Tânia Raquel Bessa; Costa, Ana Raquel Ferreira da; Duarte, Ana Catarina AbreuTaste provides essential sensory information comprising five primary flavors: sweet, bitter, umami, sour, and salty. While traditionally recognized for their role in gustation at the oral cavity, bitter (TAS2R) and sweet/umami (TAS1R) taste receptors are also expressed in various extraoral tissues, including the brain, where they participate in physiological functions. In the context of cancer, these taste receptors have emerged as significant modulators influencing tumor cell proliferation, apoptosis, migration, metabolic adaptation, and therapeutic response. Glioblastoma, the most aggressive primary brain tumor with poor prognosis, displays complex biology and limited treatment options. Conventional therapies such as surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy often fail due to chemoresistance and tumor invasiveness. This dissertation aims at expanding preliminary findings of our research group, by investigating the expression of sweet and bitter taste receptors in human glioblastoma tissue samples and in patient-derived glioblastoma cells from both the tumor core and the invasive margin. First, we confirmed the presence of sweet (subunits TAS1R2 and TAS1R3) and bitter (TAS2R4, TRAS2R5, TAS2R14, TAS2R39 and TAS2R43) taste receptors in human brain tumor samples and in patient-derived glioblastoma cells. Immunohistochemistry and immunocytochemistry followed by automated quantification using QuPath software were performed to evaluate receptor expression in tissue sections across astrocytoma (grades 1–4) and in patient-derived glioblastoma cells isolated from the tumor core and the invasive margin. The results confirmed the presence of both bitter and sweet taste receptors in brain tumor tissues, and quantification revealed heterogeneous expression across patients. In patient-derived glioblastoma cells, the astrocytic profile was validated by GFAP staining, and several taste receptors showed elevated expression, despite the absence of significant differences between cells from the tumor core and the invasive margin. Overall, these findings advance the understanding of the role of both sweet and bitter taste receptors beyond gustation, implicating them as potential biomarkers and/or therapeutic targets in glioblastoma.
- Pesquisa de marcadores químicos para o aroma a caudas, um defeito de aroma em aguardentes vínicas: abordagem olfactométricaPublication . Lopes, Diogo Duarte Nunes ; Caldeira, Ilda Maria Justino; Anjos, Ofélia Maria Serralha dos; Alba, Maria Eugénia GallardoO aroma a caudas constitui um defeito sensorial em aguardentes vínicas, geralmente originado por práticas inadequadas de destilação. Este defeito compromete a qualidade organolética da aguardente, sendo caracterizado por aromas intensos a oleoso, suado e desagradáveis, que se manifestam nas frações finais do processo de destilação. O presente estudo teve como principal objetivo identificar potenciais marcadores químicos responsáveis pelo aroma a caudas, recorrendo a uma abordagem sensorial e química. Foram obtidos destilados vínicos a partir de dois vinhos monovarietais, das castas ‘Tália’ e ‘Palomino Fino’, bem como de um vinho com defeito, utilizando um alambique tradicional do tipo Charentais, tendo se recolhido para análise, as frações de destilação. Procedeu-se à análise sensorial por um painel treinado, com vista à avaliação da intensidade do aroma a caudas. As amostras selecionadas, com maior intensidade no defeito caudas, foram submetidas a várias análises de cromatografia: cromatografia de gases associada à olfatometria (GC-O), cromatografia de gases com deteção por ionização de chama (GC-FID) e cromatografia de gases acoplada a espectrometria de massa (GCMS). Entre os principais compostos odorantes identificados nas frações de caudas destacaram-se diversos ácidos voláteis, como os ácidos hexanóico, octanóico, decanóico e isovalérico, com descritores de aroma como “suor”, “ranço” e “queijo”. Apesar destas notas desagradáveis, foram igualmente identificados compostos com aromas agradáveis, como o 2-feniletanol, o diacetil e o 1-propanol, evidenciando que as caudas apresentam um perfil aromático complexo. Os resultados obtidos apoiam a hipótese de que o aroma a caudas resultará do efeito combinado de diversos compostos odorantes, tanto agradáveis como desagradáveis. Estes resultados contribuem para a definição de marcadores químicos com potencial aplicação no controlo de qualidade do processo de destilação
- Desenvolvimento de Soluções Sustentáveis para Resíduos Têxteis HospitalaresPublication . Mendes, Carla Manuela Fonseca; Belino, Nuno José Ramos; Barata, Teresa Raquel Aurélio da Silva NunesAtualmente, as preocupações relacionadas com o consumo excessivo de recursos e com os danos causados ao meio ambiente têm aumentado significativamente, o que contrasta, de maneira marcante, com os padrões observados há alguns anos. Discutir esses fatores implica abordar conceitos como sustentabilidade, economia circular e controlo de resíduos. As instituições públicas não são exceção a essa dinâmica. O desperdício de qualquer material deve ser evitado por uma série de razões, tanto económicas, quanto ambientais. Embora os hospitais sejam unidades operacionais distintas de outras instituições, a prestação de cuidados de saúde não pode ser utilizada como justificativa para o desinteresse na adoção de políticas de controlo de resíduos e recursos. Embora já existam diversas iniciativas voltadas para a contenção e controlo de recursos nas instituições de saúde, é cada vez mais imperativo promover a implementação dessas medidas e incentivar ações de melhoria contínua nesse contexto. Hospitais são produtores de toneladas de resíduos, incluindo resíduos têxteis que, por se classificarem como hospitalares, são eliminados sem qualquer valorização. Foi nesse enquadramento que foram desenvolvidos têxteis que poderão ser usados em ambiente hospitalar e geriátrico, aproveitando resíduos têxteis provenientes de unidades de saúde, nomeadamente, fardamentos e têxteis provenientes das unidades dos doentes, cujo destino seria o aterro ou incineração. A investigação procurou aplicar os princípios da economia circular, criando várias estruturas têxteis a partir de resíduos de têxteis reutilizáveis e descartáveis, por meio da reciclagem mecânica e termomecânica, originando artigos que poderão ser utilizados em ambiente de prestação de cuidados, com características semelhantes aos produtos originais. A possibilidade de reciclagem deste tipo de resíduo apresenta uma mais valia, não só para as unidades de saúde, que deixam de ter que pagar para eliminar os resíduos têxteis, mas também representa um ganho para o ambiente, transformando um material tido como um resíduo, numa matéria prima.