FC - DQ | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento
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- 3D computational simulation and experimental characterization of polymeric stochastic network materials : case studies in reinforced eucalyptus office paper and nanofibrous materialsPublication . Curto, Joana Maria Rodrigues; Simões, Rogério Manuel dos Santos; Portugal, António Torres GarciaThe properties of stochastic fibrous materials like paper and nanowebs are highly dependent on those fibers from which the network structure is made. This work contributes to a better understanding of the effect of fiber properties on the network structural properties, using an original 3D fibrous material model with experimental validation, and its application to different fibrous materials used in reinforced Eucalyptus office paper and nanofibrous networks. To establish the relationships between the fiber and the final structural material properties, an experimental laboratorial plan has been executed for a reinforced fibrous structure, and a physical based 3D model has been developed and implemented. The experimental plan was dedicated to an important Portuguese material: the reinforced Eucalyptus based office paper. Office paper is the principal Portuguese paper industry product. This paper is mainly produced from Eucalyptus globulus bleached kraft pulp with a small incorporation of a softwood pulp to increase paper strength. It is important to access the contribution of different reinforcement pulp fibers with different biometry and coarseness to the final paper properties. The two extremes of reinforcement pulps are represented by a Picea abies kraft softwood pulp, usually considered the best reinforcement fiber, and the Portuguese pine Pinus pinaster kraft pulp. Fiber flexibility was determined experimentally using the Steadman and Luner method with a computerized acquisition device. When comparing two reinforcement fibers, the information about fiber flexibility and biometry is determinant to predict paper properties. The values presented correspond to the two extremes of fibers available as reinforcement fibers, regarding wall thickness, beating ability and flexibility values. Pinus pinaster has the thickest fiber wall, and consequently it is less flexible than the thinner wall fibers: Pinus sylvestris and Picea abies. Experimental results for the evolutions of paper properties, like paper apparent density, air permeability, tensile and tear strength, together with fiber flexibility for the two reinforcement fibers, constitute valuable information, also applicable for other reinforcement fibers, with fiber walls dimensions in this range. After having quantified the influence of fiber flexibility, we identified that this is as a key physical property to be included in our structural model. Therefore, we chose to develop a 3D network model that includes fiber bending in the z direction as an important parameter. The inclusion of fiber flexibility was done for the first time by Niskanen, in a model known as the KCL-Pakka model. We propose an extension of this model, with improvements on the fiber model, as well as an original computational implementation. A simulator has been developed from scratch and the results have been validated experimentally using handmade laboratory structures made from Eucalyptus fibers (hardwood fibers), and also Pinus pinaster, Pinus Sylvestris and Picea abies fibers, which are representative reinforcement fibers. Finally, the model was modified and extended to obtain an original simulator to nanofibrous materials, which is also an important innovation. In the network model developed in this work, the structure is formed by the sequential deposition of fibers, which are modeled individually. The model includes key papermaking fiber properties like morphology, flexibility, and collapsibility and process operations such as fiber deposition, network forming or densification. For the first time, the model considers the fiber microstructure level, including lumen and fiber wall thickness, with a resolution up to 0.05μm for the paper material case and 0.05nm for the nanofibrous materials. The computational simulation model was used to perform simulation studies. In the case of paper materials, it was used to investigate the relative influence of fiber properties such as fiber flexibility, dimensions and collapsibility. The developed multiscale model gave realistic predictions and enabled us to link fiber microstructure and paper properties. In the case of nanofibrous materials, the 3D network model was modified and implemented for Polyamide-6 electrospun and cellulose nanowebs. The influence of computational fiber flexibility and dimensions was investigated. For the Polyamide-6 electrospun network experimental results were compared visually with simulation results and similar evolutions were observed. For cellulose nanowebs the simulation study used literature data to obtain the input information for the nanocellulose fibers. The design of computer experiments was done using a space filling design, namely the Latin hypercube sampling design, and the simulations results were organized and interpreted using regression trees. Both the experimental characterization, and computational modeling, contributed to study the relationships between the polymeric fibers and the network structure formed.
- Acanthus mollis como fonte de compostos biologicamente ativosPublication . Marques, Mariana Ribeiro; Amaral, Maria Emília da Costa Cabral; Duarte, Ana Paula CoelhoA utilização de plantas medicinais para a prevenção o e tratamento de doenças é uma das mais antigas práticas medicinais do homem. A determinação dos constituintes bioativos de uma planta com potencial terapêutico, oferece variadíssimas oportunidades para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi melhorar o conhecimento sobre as propriedades biológicas de extratos obtidos a partir do Acanthus mollis, L. (acanto), uma espécie sobre a qual são praticamente inexistentes estudos científicos, e a sua possível valorização como fonte de produtos naturais para uso terapêutico e/ou nutracêutico. Neste estudo avaliou-se o potencial antioxidante e citotóxico de extratos metanólicos e etanólicos de folhas e flores do acanto. Para alguns grupos de metabolitos secundários (fenóis, flavonoides e alcaloides) determinaram-se alguns dos compostos fitoquímicos, bem como, a influência do procedimento de extração, usando a extracção em Soxhlet e extração assistida por ultrassons, contemplando neste caso, o tamanho de partícula. O teor médio em fenóis totais foi avaliado pelo método do reagente de Folin-Ciocalteu; para quantificar os flavonoides totais recorreu-se ao método colorimétrico com cloreto de alumínio e o teor de alcaloides totais foi estimado pelo método do reagente de Dragendorff. A atividade antioxidante foi determinada pelo teste do 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH). A avaliação da citotoxicidade foi feita pelo teste do brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para a viabilidade celular e a proliferação foi analisada através do doseamento de proteínas por ácido bicinconínico (BCA). A maioria dos extratos estudados apresentam um teor significativo de metabolitos secundários (fenóis, flavonoides e alcaloides), sendo o método de extração por ultrassons o que apresentou melhores resultados, nomeadamente para o menor tamanho de partícula. Os resultados obtidos mostraram que o teor em fenóis totais, variou entre 57,4 ± 7,67 e 200,5 ± 2,86 miligramas de equivalentes de ácido gálico (mg EAG) por grama de matéria seca. Os flavonoides totais e ao alcaloides apresentam teores que variam entre 13,8 ± 1,03 e 57,2 ± 2,24 miligramas de equivalentes de quercetina (mg EQ) por grama de matéria seca, e 50,4 ± 0,004 e 746,0 ± 0,03 miligramas de equivalentes de nitrato de pilocarpina (mg ENP) por grama de matéria seca. Os resultados para o índice de atividade antioxidante variaram entre 0,90 ± 0,03 e 1,61± 0,31 para os extratos, mostrando que todos eles apresentaram uma atividade antioxidante significativa. Nos estudos de citotoxicidade todos os extratos provaram ser citóxicos para células do adenocarcinoma da mama humano (MCF-7) e o extrato metanólico das flores, obtido por Soxhlet, apresenta toxicidade seletiva para estas células relativamente aos fibroblastos dérmicos normais humanos (NHDF).
- Ações da vitamina D na regulação da Regucalcina no cancro da próstataPublication . Rodrigues, Ana Margarida Pereira; Batista, Cláudio Jorge Maia; Socorro, Sílvia Cristina da Cruz MarquesCancro da próstata é o segundo cancro maligno mais diagnosticado na população masculina. Baixos níveis de vitamina D tem sido associados ao desenvolvimento e/ou progressão do cancro da próstata. Vitamina D pode ser produzida na pele, durante a exposição solar, ou provinda da dieta. Calcitriol, a forma ativa da vitamina D, quando ligada ao seu recetor, regula a expressão de uma variedade de genes que estão associados com a homeostase do cálcio e também associados ao crescimento celular, diferenciação e apoptose. Esta hormona é então um regulador da homeostase de cálcio intracelular, mas também um modulor efetivo da proliferação celular e da diferenciação em diferentes tipos de células, como é o caso do cancro da próstata. O desequilíbrio entre a morte celular e a proliferação, está na base da carcinogénese e a transformação maligna das células tem sido associada a alterações na sinalização de cálcio. Regucalcina é uma proteína que tem como papel importante na manutenção da homeostase de cálcio e também na regulação da expressão de algumas proteínas importantes nas vias de sinalização intracelular. Estudos do nosso grupo comprovam que a regucalcina está subexpressa no cancro da próstata. Este projeto de investigação tem como objetivo verificar o efeito anticancerígeno da vitamina D através da regulação da regucalcina. Para isso, utilizou-se a técnica de PCR em tempo real para avaliar a expressão da regucalcina nas células PNT1A, LnCap e PC3 estimuladas com a vitamina D. Nos resultados obtidos, nas linhas PNT1A e LnCaP observou-se uma diminuição significativa da expressão do mRNA regucalcina enquanto que na linha PC-3 houve uma aumento da expressão. Concluímos que possivelmente a vitamina D tem ações anticancerígenas apenas em estados tardios do cancro da próstata, aumentando a expressão da regucalcina e assim regredir a progressão do cancro.
- Acoustic "wall-less" test tubes for cell biology in type 2 diabetes related researchPublication . Lemos, Sandra; Nilsson, Staffan; Cabral, Ana Cristina Mendes DiasNew insights into biomedicine and related areas require the parallel development of new analytical methods. A technique for chemical analysis based on the use of acoustically levitated droplets, suitable for the study of intra and extracellular reactions at single or few cells level has been developed. Microenvironments suited for specific cell types and cell reactions can be created in levitated droplets to serve as biomimetic systems. The applicability of the Airborne System is broad and circumvents limitations associated with chip-based analytical systems, such as adsorption of the analytes or optical interferences at the walls of the sample containers. Furthermore, the low attomole detection limit highlights the potential of the method. Dysfunctional adipocytes and insulin-producing pancreatic β-cells are dynamic parts in the development of type 2 diabetes. The mechanisms involved are however not yet fully understood. With this project we aim to give our contribution for the understanding of the phenomena associated with the development of the disease and at the same time provide science with new tools which can be useful in the pursuit of new knowledge, as well as in the development of novel drugs, both in type 2 diabetes or in other metabolic diseases. The system was here applied in cellular studies at the single/few cell level. Reagents are added to the droplet using flow-through dispensers, with no physical contact with the droplet. After exposure of the cells to drugs, activators or inhibitors, the cell response (or lack of response) is monitored using fluorescence imaging detection and MALDI-TOF-MS. Adipocyte lipolysis was followed. Stimulation of lipolysis with isoprenaline resulted in a pH decrease detectable by this methodology. Moreover, the addition of insulin resulted in the inhibition of isoprenaline stimulated lipolysis in adipocytes in the levitated droplet. The addition of glycated insulin to an adipocyte containing droplet revealed not to be as effective to stop lipolysis as non-glycated insulin, which is na important finding in the search for new targets in type 2 diabetes related research. Additionally, we are now attempting to develop techniques which can interrogate and monitor analytes of interest in a levitated droplet, non-destructively, ondemand, and over extended periods of time and in real-time by MS. In current work droplet fission is induced by polarization in a containerless environment. Various electrode configurations are attempted varying parameters such as number and shape, voltage, pulse length and frequency for the applied electric field in order to get the proper droplet response. Miniaturization and single-cell analysis could ultimately result in a decreasing of the number of animal trials necessary in medical research.
- Actividade antimicrobiana do Chá Verde dos Açores e sobre Gardnerella vaginalis e Lactobacillus spp.Publication . Marques, Daniela Patrícia Abrantes; Oliveira, Ana Cristina Palmeira de; Silva, Branca Maria Cardoso Monteiro daA maior causa de consulta médica por parte das mulheres são as infecções vaginais e tem sido descrita uma procura maior de produtos com base em compostos naturais para o seu tratamento. A bacteriose vaginal é a infecção genital mais comum considerando-se que a presença de Gardnerella vaginalis parece ser a principal causa etilógica visto estar descrita em 95% dos casos. Esta bactéria é anaeróbia, Gram negativa mas com alguma variabilidade na coloração, dependendo da fase de crescimento em que se encontra e possui uma grande capacidade de adesão importante na patologia e diagnóstico de bacteriose vaginal pela formação de células epiteliais vaginais esfoliadas revestidas com G. vaginalis, conhecidas como ‘’clue cells’’. Diversos estudos têm como objecto a actividade antimicrobiana de compostos naturais devido ao aumento das resistências dos microrganismos aos antibióticos convencionais, criando assim uma terapêutica alternativa. Por outro lado a população lactobacilar parece desempenhar um papel protector, visto o seu papel probiótico, sendo a sua presença utilizada como um dos marcadores de flora vaginal normal. O uso de chá de Camellia sinensis em estudos científicos indica que é uma fonte natural e pouco dispendiosa de polifenóis, tais como os derivados de catequinas, que são conhecidos pelas suas propriedades antimicrobianas. Os benefícios do chá estão relacionados com a elevada quantidade de catequinas que constituem cerca de 30% do peso seco das folhas, sendo as principais a (-) epicatequina (EC), (-) epicatequina-3-galhato (ECG), (-) epigalhocatequina (EGC) e (-) epigalhocatequina-3-galhato (EGCG), sendo esta última catequina a que se encontra em maior quantidade no chá verde. Neste trabalho laboratorial avaliou-se o potencial antimicrobiano do extrato aquoso de chá verde dos Açores sobre estirpes de Gardnerella vaginalis, verificou-se a sobrevivência dos Lactobacillus spp. aquando da aplicação deste extrato aquoso e avaliou-se o mecanismo de acção do extrato aquoso de chá verde em Gardnerella vaginalis por citometria de fluxo. Os resultados sugerem que as estirpes de Lactobacillus spp. sobrevivem na presença do extrato aquoso de chá verde e as estirpes de Gardnerella vaginalis são susceptíveis ao mesmo extracto em concentração de CMI de 0,63mg/mL. Os resultados de citometria mostraram-se inconclusivos para este estudo. Deste modo, o extrato aquoso de chá verde dos Açores apresenta-se como um potencial agente terapêutico natural e de baixo custo, com potencial interesse nomeadamente na bacteriose vaginal.
- Actividade antioxidante de plantas medicinais angolanasPublication . Fernandes, Nélson António Freitas; Mendonça, António José Geraldes de; Mendonça, Dina Isabel Malheiros Dinis deNos últimos anos tem crescido o interesse pela descoberta de novos compostos antioxidantes, a partir de fontes naturais, aplicáveis quer na indústria alimentar como na medicina preventiva. Neste trabalho foi estudada a capacidade antioxidante de extractos de dez plantas medicinais Angolanas em diferentes solventes orgânicos (Hymenodictyon floribundum, Parinari pumila, Tinnea antiscorbutica, Eragrostis viscosa, Xylopia odoratissima, Peucedanum angolense, Boscia microphylla, Adenodolichos huillensis, Cassia occidentalis e Rhus kirkii). A capacidade antioxidante foi avaliada por quatro métodos in vitro (ABTS, DPPH, TBA e Valor peróxido). A concentração de compostos fenólicos totais nos extractos foi determinada pelo método de Folin- Ciocalteau. Os compostos fenólicos totais variam entre 40,63mg/g extracto ± 0,00 para a Eragrostis viscosa em diclorometano e 549,27mg/g extracto ± 0,01 para a Parinari pumila aquoso. A percentagem mais elevada de inibição de radicais livres de DPPH, quando em comparação com uma solução de Trolox na mesma concentração dos extractos (69,79 % ± 0,43), foi observada no extracto de Parinari pumila em metanol com um valor de 36,19 % ± 0,21. Para o método de ABTS, o valor mais alto de TEAC e de percentagem de inibição, foi observado para o extracto de Hymenodictyon floribundum em acetato de etilo, respectivamente com o valor de 3,24 mM Trolox/g extracto ± 0,52 e 5,71 % ± 0,52. No teste de TBA, os extractos de Parinari pumila e Hymenodictyon floribundum são alguns dos que se mostraram menos eficazes na prevenção da oxidação do ácido linoleico, embora onze dos extractos tenham apresentado uma capacidade antioxidante equivalente à do BHA. Relativamente ao valor peróxido, o extracto com melhor capacidade em diminuir a oxidação ao longo dos oitos dias, foi o de Adenodolichos huillensis folhas aquoso, com um valor de 37,47meq / g extracto ± 0,20. Uma vez que a composição química dos diferentes extractos não é conhecida, será necessário isolar e purificar os diferentes compostos químicos presentes nos extractos.
- Actividades elementares sobre som e luzPublication . Pinto, Vitor Miguel Barata; Costa, João Pinheiro da Providência eAs aulas de Física e Química no ensino básico devem favorecer uma cultura científica que estimule o espírito crítico e participativo, promovendo o desejo e o gosto de aprender. Este projecto pretende promover estes estímulos através da realização de aulas experimentais que contemplem actividades que consolidem os conceitos significativos e as ideias cientificamente aceites sobre o som e a luz. As actividades foram seleccionadas e adaptadas a partir de manuais escolares e livros de divulgação científica utilizados em Portugal, França, Brasil e Estados Unidos da América. Todas as actividades são enquadradas com o desenvolvimento teórico necessário à sua compreensão e, ao mesmo tempo, contribuem, em muitos casos, para a reestruturação das ideias prévias que os alunos possuem sobre som e luz. Este projecto envolveu vinte e oito alunos do oitavo ano de escolaridade e, ao mesmo tempo que acompanhava o cumprimento do programa previsto para este nível, procurou-se estimular os alunos a expor as suas ideias, a pesquisar e, nalguns casos, orientá-los na planificação de actividades que comprovem essas ideias. Este estudo é limitado pelo número de alunos e o tempo disponível para a leccionação da disciplina de ciências físico-químicas no oitavo ano de escolaridade. No entanto, os resultados obtidos comprovam que a realização de actividades experimentais diversificadas e que muitas vezes fazem uso de material simples disponível em todos os laboratórios e a utilização das tecnologias de informação e comunicação possibilita uma aprendizagem significativa dos conceitos e um maior interesse pelas ciências experimentais.
- Administração Intranasal de Segesterona para Neuroproteção: Caracterização, Estabilidade, Libertação e Segurança In Vitro de FormulaçõesPublication . Silva, Samille Ferreira da; Santos, Adriana Oliveira dos; Peres, Carina Sofia GonçalvesO acidente vascular cerebral isquémico é uma das principais causas de morte e a principal causa de incapacidade a longo prazo em todo o mundo. Em razão do número reduzido de opções terapêuticas e das suas limitações, há necessidade de encontrar formas alternativas de prevenir e tratar casos de acidente vascular cerebral isquémico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a estabilidade física e química, a libertação do fármaco, e a segurança de formulações de acetato de segesterona (AS) previamente desenvolvidas, uma microemulsão (ME) e três nanoemulsões O/A, uma neutra (NEn), uma aniónica e viscosa (NEa) e uma catiónica (NEc), diluídas para se atingir uma concentração alvo de AS de cerca de 0,48 mg/mL. Foi desenvolvido e validado um ensaio de cromatografia líquida acoplado a deteção UV para a quantificação de acetato de segesterona. Testes de estabilidade física e química de longo prazo foram conduzidos a três temperaturas de armazenamento diferentes (4 °C, 25 °C e 40 °C) em dois lotes independentes. Perfis de libertação do AS in vitro foram caracterizados usando Câmaras de Ussing horizontal. Adicionalmente, a segurança das formulações foi testada usando um modelo comercial tridimensional de tecido nasal humano cultivado in vitro (MucilAirTM, Epithelix). Foi feita avaliação da resistência transepitelial (TEER, do Inglês transepithelial electrical resistance), da libertação de Lactato Deshidrgenase (LDH) para o meio basal e 0 ensaio de redução da resazurina. A respeito da estabilidade física, na ME houve aumento de tamanho médio e PDI ao longo do tempo a todas as temperaturas, embora mais acentuado a 40 °C. Foi ainda possível verificar a ocorrência de precipitação do fármaco, principalmente a 4 °C, mas isto poderia ser prevenindo reduzindo a concentração inicial do fármaco. Ainda assim, a 4 °C e 25 °C o tamanho médio de gotícula manteve-se < 100 nm e os valores de PDI < 0,3, que podem ser considerados valores aceitáveis. Quanto à NEa, esta foi apenas estável do ponto de vista de tamanho médio (< 200 nm) e PDI (< 0,2) apenas a 4 °C. A sua viscosidade manteve-se estável a 4 °C e 25 °C. A NEc manteve um tamanho médio próximo de 100 nm e PDI < 0,2 às 3 temperaturas, embora o PDI até tenha sido mais baixo a temperaturas = 25 °C. A NEn mostrou um tamanho médio dependente da temperatura, sendo significativamente mais baixo a 4 °C. O PDI não teve grandes variações a não ser a 40 °C, mas mantendo-se inferior a 0,2. Quanto à estabilidade química, esta foi influenciada pela precipitação observada na ME, que foi responsável pela redução do nível de fármaco quantificado na ME ao longo do tempo. Houve também uma redução da concentração do fármaco na NEa. Nos primeiros lotes de NEc e de NEn, a concentração de fármaco permaneceu relativamente estável ao longo do tempo. Contudo, houve uma diminuição da concentração de AS a 40 °C na NEc no lote 2. No que diz respeito ao perfil de libertação, foi possível constatar a rápida velocidade de libertação inicial, a partir das nanoemulsões neutras e catiónicas, semelhante ou ainda superior à velocidade conseguida com o controlo positivo, e a redução da velocidade de libertação a partir das formulações aniónicas, mais viscosas. As ME originaram resultados semelhantes aos obtidos com o controlo negativo. Contudo, nenhuma levou a uma libertação completa nas 6 h do estudo. Quanto à segurança in vitro, A ME foi segura à concentração usada e a NEn mais diluída (0,135 mg/mL AS) não levou a uma alteração significativa do TEER nem libertação de LDH, mas afetou inibiu parcialmente a redução da resazurina. As NEa, NEc e NEn impactaram o TEER e a redução da resazurina, mas a mucosa pareceu recuperar. A NEc pareceu mais tóxica, com diminuição mais acentuada do TEER e da metabolização de resazurina. Concluindo, as formulações mais estáveis foram as nanoemulsões neutras e catiónicas, a 4 °C e 25 °C, respetivamente. O perfil de libertação do fármaco a partir destas formulações é também mais rápido embora, não tenha sido completo. Em relação à segurança das formulações, as ME são mais seguras, o que era esperado. No entanto, todas as formulações foram mais seguras que os controlos positivos usados e permitiram a recuperação do TEER para valores normais. Em suma, tanto a ME como a NEn são bom candidatos para avançar para estudo in vivo de administração intranasal de AS, e podem vir a ser uma boa estratégia para explorar as propriedades neuroprotetoras do acetato de segesterona no acidente vascular cerebral isquémico.
- Adverse vascular effects of phthalates: Possible contribution to hypertension in pregnancyPublication . Mariana, Melissa Rodrigues; Oliveira, Maria Elisa Cairrão Rodrigues; Soares, Amadeu Mortágua Velho da Maia; Sousa, Miguel Castelo Branco Craveiro dePhthalates are chemical compounds used as plasticizers to increase flexibility and elasticity of rigid polymers and as non-plasticizers as solvents and additives in cosmetics and personal care products. These compounds have low water solubility and since they are not covalently bound to the polymer they are easily released into the environment and absorbed by the human body. Afterwards, phthalates are rapidly metabolized into their respective monoesters being already detected in different biological samples, including blood, urine, saliva, amniotic fluid, umbilical cord blood and breast milk. In addition, phthalates can disrupt the endocrine system by binding to molecular targets and interfering with hormonal homeostasis, thus being classified as endocrine-disrupting compounds (EDCs). Due to these properties and their adverse effects, phthalates were classified as priority environmental pollutants by the United States Environmental Protection Agency (US EPA). Alongside this increase in exposure to phthalates, the incidence of cardiovascular diseases (CVD) has also increased over the years, with the occurrence of hypertensive disorders in pregnancy (HDP) being one of the main causes of maternal and foetal morbidity and mortality. There are several risk factors that influence the development of HDP, including exposure to EDCs, but the mechanisms involved are not yet known. Several studies have also suggested an association with phthalates, in rats they seem to promote changes in the vascular function, to affect the expression of proteins involved in cardiac function, to contribute to increased blood pressure, changes in lipid metabolism, and atherosclerosis. Thus, the aim of this thesis was to investigate how phthalates’ exposure affects the cardiovascular health, focusing on HDP. For that, studies were carried out on rat aorta and the human umbilical artery to evaluate the effects of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and diethyl phthalate (DEP) in the vascular function. In the first study, rat aorta devoid of endothelium was contracted with noradrenaline and potassium chloride (KCl) and then subjected to different concentrations of DEHP (0.001-100 μM) to assess the vascular reactivity. Besides, since Ca2+ levels are the main determinant of contraction and relaxation, DEHP effects on Ca2+ currents were also analysed using the A7r5 cells. The data obtained showed that DEHP caused a concentration-dependent vasorelaxation after contraction with KCl, and, at the highest concentrations, it inhibited both the basal and the BAY K8644-stimulated calcium currents. These results suggest that DEHP induces vasorelaxation of the rat aorta by inhibiting the L-type Ca2+ channels (LTCC). Then, the genomic and non-genomic effects of DEP on the rat aorta were analysed. Using the organ bath technique, DEP (0.001-1000 μM) was analysed after contraction of the arteries with noradrenaline and KCl. Similarly, to understand the possible mechanisms involved, the effects of DEP were analysed on the relaxing effect of nifedipine (NIF - specific calcium channel blocker) and sodium nitroprusside (SNP - soluble guanylate cyclase activator). Besides, through electrophysiology studies the non-genomic (occurring within a few minutes) and genomic (occurring after 24h of exposure) effects of DEP on the Ca2+ currents of the A7r5 cells were investigated. These showed that both the rapid and 24h effects of DEP exposure led to a decrease in LTCC currents, being in agreement with the vasorelaxation obtained through the organ bath experiments. For the first time, the vascular electrophysiological properties of an EDC were analysed after long-term exposure, concluding that DEP promotes an inhibition of the calcium current in the rat aorta, which may be responsible for electrical disturbances such as arrhythmias. To evaluate the effect of phthalates on maternal health, the last experimental work of this thesis analysed the contribution of DEP (0.001-1000 μM) in the development of gestational hypertension. Therefore, human umbilical arteries (HUA) were collected from normotensive and hypertensive pregnant women. To assess the non-genomic vascular effects, the HUA were pre-contracted with serotonin, histamine and KCl and then subjected to DEP, resulting in a vasorelaxation by interfering with Ca2+ channels and serotonin and histamine receptors. On the other hand, to assess the genomic effects, the arteries were incubated with DEP for 24h, and then the effects of NIF and SNP were analysed. The results showed that DEP seemed to act through the NO/sGC/cGMP/PKG signalling pathway, and to interfere with LTCC. In addition, primary culture of HUA smooth muscle cells was also performed for cell viability essays, showing that DEP has no toxic effect on these cells. Overall, this experimental work showed that DEP affects the HUA vascular resistance through disturbances in hormone and calcium homeostasis, suggesting that the development of hypertension in pregnancy may be a consequence of exposure to phthalates. In general, the results obtained show that phthalates modify the vascular homeostasis in both animals and humans, promoting vasorelaxation mainly through the inhibition of Ca2+ channels. This is the first time that an experimental study has been able to establish the link between exposure to DEP and gestational hypertension. We are beginning to unravel the mechanistic pathways involved in the vascular effects of phthalates that explain the pathological functional alterations of hypertension in pregnancy. However, more experimental studies are needed to understand how different classes and mixtures of phthalates affect the cardiovascular health during pregnancy and in future generations.
- Affinity chromatography in plasmid DNA purification for therapeutic applicationsPublication . Sousa, Ângela Maria Almeida de; Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues; Sousa, Fani Pereira deThe discovery of disease-related genes and the possibility to manipulate the gene set-up in some organisms has fostered the development of innovative human DNA therapeutics over the last years. Although viral vectors are used in the majority of the trials, non-viral vectors, particularly plasmid DNA (pDNA) vectors, are attracting considerable attention as biotherapeutics both in gene therapy or DNA vaccination, due to their lower immunogenicity, toxicity and also the economic, safer and easier manufacture. Nevertheless, it is well known that the success of gene transfer to cells and subsequent expression is strictly affected by the pDNA manufacturing process. The use of pDNA-based therapeutics relies on procedures that efficiently purify the most biologically active and effective topology, the supercoiled (sc) plasmid conformation. However, chromatographic purification of sc pDNA has specific problems which are mostly related to the structural nature of this biomolecule, the resemblance between pDNA topologies and also with some host impurities, as well as the lack of capacity and selectivity of the traditional bead adsorbents. Recently, sc pDNA purification strategies that use amino acids as immobilized ligands have yielded interesting results. Thus, the present work intends to explore and understand the underlying interactions responsible for the biorecognition of sc conformation by the amino acids ligands already used for pDNA purification as well as to establish the elution conditions that favor the prevalence of some interactions on other. By performing some fundamental studies with oligonucleotides it was observed the involvement of several elementary interactions with the amino acids matrices studied, such as hydrophobic, ring-stacking, cation-π, water-mediated bonds, multiple hydrogen bonds, van der Waals and electrostatic interactions. Although hydrophobic interactions easily appear with histidine matrix or ionic interactions with arginine matrix, it was verified the presence of other interactions in function of the elution conditions used. These results were useful for the implementation of a new affinity chromatographic strategy with the amino acid lysine for efficiently and selectively purify the sc pDNA isoform. Lysineaffinity matrix allowed the elimination of the E. coli impurities as well as other ineffective plasmid isoforms present in a complex clarified lysate meeting all the regulatory requirements. The preferential retention of the nucleic acids with higher bases exposure indicates that this matrix can be more suitable for RNA purification. In accordance with the traditional supports limitations, the alternative monolithic chromatography revealed satisfactory affinity properties with excellent mass transfer and capacity characteritics, allowing a fast and efficient plasmid isoforms separation without flow rate dependence. The similar elution conditions with histidine-agarose and the presence of canbonyldiimidazole groups suggested that the imidazole ring present in this monolithic disk is the major responsible in the specific biorecognition of sc pDNA isoform. Integration of monolithic chromatography in the pDNA manufacturing process also increase the global yield of pDNA xviiirecovery for 89%, with a purity degree according to the recommendations of the regulatory agencies that was reflected in the high transfection efficiency of sc pDNA sample on eukaryotic cells (59% in COS-7 cells). Overall, this doctoral research work revealed that amino acid-based affinity chromatography is a powerful and versatile methodology for nucleic acids purification, mainly the sc pDNA topology, guaranteeing suitable purity degree for DNA-based therapies. Besides the selectivity and specificity obtained with amino acids affinity ligands, the application of the innovative monolithic technology in the pDNA purification field brought a great improvement of the speed, resolution and capacity to the chromatographic performance, being a promising association for plasmid purification technology. Hence, this work provided valuable and helpful information concerning amino acid-affinity chromatography and chromatographic supports that can be useful in the future pDNA bioseparation either for preparative and analytical processes.