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Administração Intranasal de Segesterona para Neuroproteção: Caracterização, Estabilidade, Libertação e Segurança In Vitro de Formulações

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Abstract(s)

O acidente vascular cerebral isquémico é uma das principais causas de morte e a principal causa de incapacidade a longo prazo em todo o mundo. Em razão do número reduzido de opções terapêuticas e das suas limitações, há necessidade de encontrar formas alternativas de prevenir e tratar casos de acidente vascular cerebral isquémico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a estabilidade física e química, a libertação do fármaco, e a segurança de formulações de acetato de segesterona (AS) previamente desenvolvidas, uma microemulsão (ME) e três nanoemulsões O/A, uma neutra (NEn), uma aniónica e viscosa (NEa) e uma catiónica (NEc), diluídas para se atingir uma concentração alvo de AS de cerca de 0,48 mg/mL. Foi desenvolvido e validado um ensaio de cromatografia líquida acoplado a deteção UV para a quantificação de acetato de segesterona. Testes de estabilidade física e química de longo prazo foram conduzidos a três temperaturas de armazenamento diferentes (4 °C, 25 °C e 40 °C) em dois lotes independentes. Perfis de libertação do AS in vitro foram caracterizados usando Câmaras de Ussing horizontal. Adicionalmente, a segurança das formulações foi testada usando um modelo comercial tridimensional de tecido nasal humano cultivado in vitro (MucilAirTM, Epithelix). Foi feita avaliação da resistência transepitelial (TEER, do Inglês transepithelial electrical resistance), da libertação de Lactato Deshidrgenase (LDH) para o meio basal e 0 ensaio de redução da resazurina. A respeito da estabilidade física, na ME houve aumento de tamanho médio e PDI ao longo do tempo a todas as temperaturas, embora mais acentuado a 40 °C. Foi ainda possível verificar a ocorrência de precipitação do fármaco, principalmente a 4 °C, mas isto poderia ser prevenindo reduzindo a concentração inicial do fármaco. Ainda assim, a 4 °C e 25 °C o tamanho médio de gotícula manteve-se < 100 nm e os valores de PDI < 0,3, que podem ser considerados valores aceitáveis. Quanto à NEa, esta foi apenas estável do ponto de vista de tamanho médio (< 200 nm) e PDI (< 0,2) apenas a 4 °C. A sua viscosidade manteve-se estável a 4 °C e 25 °C. A NEc manteve um tamanho médio próximo de 100 nm e PDI < 0,2 às 3 temperaturas, embora o PDI até tenha sido mais baixo a temperaturas = 25 °C. A NEn mostrou um tamanho médio dependente da temperatura, sendo significativamente mais baixo a 4 °C. O PDI não teve grandes variações a não ser a 40 °C, mas mantendo-se inferior a 0,2. Quanto à estabilidade química, esta foi influenciada pela precipitação observada na ME, que foi responsável pela redução do nível de fármaco quantificado na ME ao longo do tempo. Houve também uma redução da concentração do fármaco na NEa. Nos primeiros lotes de NEc e de NEn, a concentração de fármaco permaneceu relativamente estável ao longo do tempo. Contudo, houve uma diminuição da concentração de AS a 40 °C na NEc no lote 2. No que diz respeito ao perfil de libertação, foi possível constatar a rápida velocidade de libertação inicial, a partir das nanoemulsões neutras e catiónicas, semelhante ou ainda superior à velocidade conseguida com o controlo positivo, e a redução da velocidade de libertação a partir das formulações aniónicas, mais viscosas. As ME originaram resultados semelhantes aos obtidos com o controlo negativo. Contudo, nenhuma levou a uma libertação completa nas 6 h do estudo. Quanto à segurança in vitro, A ME foi segura à concentração usada e a NEn mais diluída (0,135 mg/mL AS) não levou a uma alteração significativa do TEER nem libertação de LDH, mas afetou inibiu parcialmente a redução da resazurina. As NEa, NEc e NEn impactaram o TEER e a redução da resazurina, mas a mucosa pareceu recuperar. A NEc pareceu mais tóxica, com diminuição mais acentuada do TEER e da metabolização de resazurina. Concluindo, as formulações mais estáveis foram as nanoemulsões neutras e catiónicas, a 4 °C e 25 °C, respetivamente. O perfil de libertação do fármaco a partir destas formulações é também mais rápido embora, não tenha sido completo. Em relação à segurança das formulações, as ME são mais seguras, o que era esperado. No entanto, todas as formulações foram mais seguras que os controlos positivos usados e permitiram a recuperação do TEER para valores normais. Em suma, tanto a ME como a NEn são bom candidatos para avançar para estudo in vivo de administração intranasal de AS, e podem vir a ser uma boa estratégia para explorar as propriedades neuroprotetoras do acetato de segesterona no acidente vascular cerebral isquémico.
Ischemic stroke is a leading cause of death and the leading cause of long-term disability worldwide. Due to the limited number of therapeutic options and their limitations, there is a need to find alternative ways to prevent and treat ischemic stroke. The objective of this work was to characterize and evaluate the physical and chemical stability, drug release, and safety of previously developed segesterone acetate (SA) formulations, a microemulsion (ME) and three O/W nanoemulsions, one neutral (nNE), one anionic and viscous (aNE) and one cationic (cNE), diluted to reach a target AS concentration of around 0.48 mg/mL A liquid chromatography assay coupled to UV detection was developed and validated for the quantification of segesterone acetate (SA). Long-term physical and chemical stability tests were conducted at three different storage temperatures (4 °C, 25 °C and 40 °C) in two independent batches. In vitro SA release profiles were characterized using horizontal Ussing Chambers. Additionally, the safety of the formulations was tested using a commercial three-dimensional model of human nasal tissue cultured in vitro (MucilAirTM, Epithelix). The transepithelial electrical resistance (TEER), the release of Lactate Dehydrogenase (LDH) into the basal medium and the resazurin reduction assay were assessed. Regarding physical stability, in the ME there was an increase in the average size and PDI over time at all temperatures, although more pronounced at 40 °C. It was also possible to verify the occurrence of drug precipitation, mainly at 4 °C, but this could be prevented by reducing the initial drug concentration. Still, at 4 °C and 25 °C the average droplet size remained < 100 nm and the PDI values < 0,3, which can be considered acceptable values. As for the aNE, it was only stable in terms of medium size (< 200 nm) and PDI (< 0,2) only at 4 °C. Its viscosity remained stable at 4 °C and 25 °C. The cNE maintained an average size close to 100 nm and PDI < 0,2 at the 3 temperatures, although the PDI was even lower at temperatures = 25 °C. nNE showed a temperature-dependent average size, being significantly lower at 4 °C. The PDI did not have major variations except at 40 °C, but remained below 0,2. Chemical stability was influenced by the precipitation observed in the ME, which was responsible for the reduction in the level of the drug quantified in the ME over time. There was also a reduction in the concentration of the drug in aNE. In the first batches of cNE and NEn, the drug concentration remained relatively stable over time. However, there was a decrease in the concentration of SA at 40 °C in the cNE in batch 2. With regard to the release profile, it was possible to verify the rapid initial release rate, from the neutral and cationic nanoemulsions, similar to or higher than the speed achieved with the positive control, and the reduction in the release rate from the anionic formulations, more viscous. The ME produced results similar to those obtained with the negative control. However, none led to complete release within the 6 h study. Regarding in vitro safety, the ME was safe at the concentration used and the more diluted NEn (0.135 mg/mL SA) did not lead to a significant change in TEER or LDH release, but partially inhibited the reduction of resazurin. The aNE, cNE and nNE impacted TEER and resazurin reduction, but the mucosa appeared to recover. The cNE appeared more toxic, with a more pronounced decrease in TEER and resazurin metabolism. In conclusion, the most stable formulations were neutral and cationic nanoemulsions, at 4 °C and 25 °C, respectively. The drug release profile from these formulations is also faster, although not complete. Regarding the safety of the formulations, the ME is safer, which was expected. However, all formulations were safer than the positive controls used and allowed TEER recovery to normal values. In summary, both ME and SEN are good candidates to advance to in vivo study of intranasal administration of AS, and may prove to be a good strategy to explore the neuroprotective properties of segesterone acetate in ischemic stroke.

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Acetato de Segesterona Acidente Vascular Cerebral Administração Intranasal Microemulsões Nanoemulsões

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