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Authors
Abstract(s)
Nucleic acids-based therapies have emerged as excellent approaches to treat various diseases
such as cancer and neurodegenerative disorders. However, for these biomolecules to be used
as biopharmaceuticals they must be obtained with high purity, presenting biological activity
and structural integrity. As these are the main challenges in obtaining biopharmaceuticals, it
is necessary to develop purification strategies that ensure their quality. Ionic liquids (ILs) are
liquid salts at room temperature that have very interesting properties, namely the vast
combination of cation and anion that can be made, thus tailoring the structures to the intended
purpose.
This work has as main objective the development of a new strategy for the purification of
nucleic acids using functionalized supports with different ILs. In addition, we also intend to
evaluate the RNA stabilizing capacity of certain ILs as well as their toxicity in human cell lines
in order to ascertain the biosafety of these substances.
Initially, different ILs were covalently immobilized onto spherical silica supports, used as a
stationary phase, resulting in the following materials: [Si][C3C1Im]Cl, [Si][N3222]Cl,
[Si][N3444]Cl, [Si][N3888]Cl and [Si][N3114]Cl. In addition to the structural characterization of
the supports, and as a screening procedure, the binding and elution of low molecular weight
RNA molecules was tested under ionic and hydrophobic conditions with all the synthesised
supports, in order to select the most promising ligand(s) for nucleic acids purification.
[Si][N3222]Cl and [Si][N3114]Cl were the chosen supports for further separation procedures
between genomic DNA and RNA. Both supports showed ability for separating these two species,
although [Si][N3114]Cl displayed better selectivity, thus becoming more promising for future
separation assays. Additionally, RNA stabilization assays were performed with four different
types of ILs, analogues to the ligands, namely [N1111]Cl, [N2222]Cl, [N3333]Cl and [N4444]Cl.
Only [N1111]Cl showed to enhance RNAs thermal stability, verifying by this, a negative
contribution of the alkyl chains lengths in the stabilization of this biomolecule. Besides,
cytotoxicity assays with the two chosen supports and these four ILs were performed. ILimmobilized supports did not present any cytotoxicity, while liquid ILs were discovered to
largely compromise cell viability. In this sense, the usage of ILs immobilized onto solid supports
appears to be safer than using bulk ILs. Thus, was possible to demonstrate the importance of
various ILs in purification and manipulation of nucleic acids, becoming a continuously growing
area.
As terapias baseadas em ácidos nucleicos têm surgido como excelentes abordagens no que diz respeito ao tratamento de diversas doenças como cancro e doenças neurodegenerativas. Contudo, para que estas biomoléculas possam ser usadas como biofármacos elas devem ser obtidas com elevados graus de pureza, apresentando atividade biológica e integridade estrutural. Sendo estes os maiores desafios na obtenção de biofármacos, é necessário desenvolver estratégias de purificação que assegurem a qualidade dos mesmos. Os líquidos iónicos (ILs) são sais líquidos à temperatura ambiente que apresentam propriedades muito interessantes, nomeadamente a possibilidade de criar inúmeras combinações entre catiões e aniões, adequando assim as estruturas aos objetivos pretendidos. Neste âmbito, o presente trabalho tem como principal objetivo o desenvolvimento de uma nova estratégia de purificação de ácidos nucleicos usando suportes funcionalizados com diferentes ILs. Paralelamente, pretende-se também avaliar a capacidade de estabilização de RNA que determinados ILs apresentam, assim como a sua toxicidade em linhas celulares humanas, de forma a averiguar a biossegurança destas substâncias. Inicialmente, diferentes ILs foram imobilizados covalentemente em suportes de sílica esférica, usada como fase estacionária, dos quais resultaram os seguintes materiais: [Si][C3C1Im]Cl, [Si][N3222]Cl, [Si][N3444]Cl, [Si][N3888] e [Si][N3114]Cl. Considerando estruturalmente os ILs selecionados, destaca-se a utilização como catião de um composto heterocíclico, um baseado em uma amina assimétrica e três com aminas simétricas que variam no tamanho da cadeia carbonada (contendo 2, 4 ou 8 carbonos). Para além da caracterização estrutural dos suportes, cada um deles foi empacotado em colunas de bancada e foram realizados ensaios de screening de ligação e eluição com amostras de RNA. Nestes ensaios, foi possível verificar que todos os ligandos tinham a capacidade de estabelecer interações electroestáticas e hidrofóbicas com o RNA, isto porque todos possuem grupos de carácter iónico e hidrofóbico, demonstrando assim a possibilidade de explorar um comportamento multimodal. Contudo, os resultados mais promissores foram obtidos com os suportes de [Si][N3222]Cl e [Si][N3114]Cl, pelo que foram estes os materiais usados nos ensaios seguintes. Neste contexto, a etapa seguinte foi de avaliação do potencial destes suportes para separar DNA e RNA presentes em amostras de lisado, considerando também o efeito do pH (entre 6 e 8) nos perfis de retenção e padrão de seletividade entre estas biomoléculas. Ambos os suportes demonstraram essa capacidade de separação, apesar de [Si][N3114]Cl ter apresentado melhor seletividade que [Si][N3222]Cl, sendo por isso mais promissor para outros estudos de separação. Adicionalmente, foram realizados ensaios de estabilização de amostras de RNA com quatro diferentes ILs, nomeadamente [N1111]Cl, [N2222]Cl, [N3333]Cl e [N4444]Cl. Com este estudo foi observado um efeito negativo na estabilidade do RNA consoante o aumento do tamanho da cadeia carbonada do catião, tendo-se apenas obtido aumento da estabilidade térmica do RNA com o IL [N1111]Cl. Por fim, e de forma a averiguar a toxicidade dos suportes e dos ILs análogos, foram realizados ensaios de citotoxicidade numa linha celular humana, em que os materiais e ILs foram colocados em contacto com as células até um período de tempo de 48 horas. Verificou-se que os suportes com os ILs imobilizados na superfície não demonstraram qualquer toxicidade para estas células, ao contrário do observado com os ILs análogos aos usados nos suportes. Estes demonstraram significativa toxicidade, que também se verificou ser dependente do tamanho das cadeias carbonadas e da concentração de IL aplicada, apresentando assim uma vantagem dos ILs imobilizados em suportes, comparativamente ao uso de ILs no estado líquido. Desta forma, foi possível demonstrar a importância de vários ILs na purificação e estabilização dos ácidos nucleicos, tratando-se de uma área em constante crescimento.
As terapias baseadas em ácidos nucleicos têm surgido como excelentes abordagens no que diz respeito ao tratamento de diversas doenças como cancro e doenças neurodegenerativas. Contudo, para que estas biomoléculas possam ser usadas como biofármacos elas devem ser obtidas com elevados graus de pureza, apresentando atividade biológica e integridade estrutural. Sendo estes os maiores desafios na obtenção de biofármacos, é necessário desenvolver estratégias de purificação que assegurem a qualidade dos mesmos. Os líquidos iónicos (ILs) são sais líquidos à temperatura ambiente que apresentam propriedades muito interessantes, nomeadamente a possibilidade de criar inúmeras combinações entre catiões e aniões, adequando assim as estruturas aos objetivos pretendidos. Neste âmbito, o presente trabalho tem como principal objetivo o desenvolvimento de uma nova estratégia de purificação de ácidos nucleicos usando suportes funcionalizados com diferentes ILs. Paralelamente, pretende-se também avaliar a capacidade de estabilização de RNA que determinados ILs apresentam, assim como a sua toxicidade em linhas celulares humanas, de forma a averiguar a biossegurança destas substâncias. Inicialmente, diferentes ILs foram imobilizados covalentemente em suportes de sílica esférica, usada como fase estacionária, dos quais resultaram os seguintes materiais: [Si][C3C1Im]Cl, [Si][N3222]Cl, [Si][N3444]Cl, [Si][N3888] e [Si][N3114]Cl. Considerando estruturalmente os ILs selecionados, destaca-se a utilização como catião de um composto heterocíclico, um baseado em uma amina assimétrica e três com aminas simétricas que variam no tamanho da cadeia carbonada (contendo 2, 4 ou 8 carbonos). Para além da caracterização estrutural dos suportes, cada um deles foi empacotado em colunas de bancada e foram realizados ensaios de screening de ligação e eluição com amostras de RNA. Nestes ensaios, foi possível verificar que todos os ligandos tinham a capacidade de estabelecer interações electroestáticas e hidrofóbicas com o RNA, isto porque todos possuem grupos de carácter iónico e hidrofóbico, demonstrando assim a possibilidade de explorar um comportamento multimodal. Contudo, os resultados mais promissores foram obtidos com os suportes de [Si][N3222]Cl e [Si][N3114]Cl, pelo que foram estes os materiais usados nos ensaios seguintes. Neste contexto, a etapa seguinte foi de avaliação do potencial destes suportes para separar DNA e RNA presentes em amostras de lisado, considerando também o efeito do pH (entre 6 e 8) nos perfis de retenção e padrão de seletividade entre estas biomoléculas. Ambos os suportes demonstraram essa capacidade de separação, apesar de [Si][N3114]Cl ter apresentado melhor seletividade que [Si][N3222]Cl, sendo por isso mais promissor para outros estudos de separação. Adicionalmente, foram realizados ensaios de estabilização de amostras de RNA com quatro diferentes ILs, nomeadamente [N1111]Cl, [N2222]Cl, [N3333]Cl e [N4444]Cl. Com este estudo foi observado um efeito negativo na estabilidade do RNA consoante o aumento do tamanho da cadeia carbonada do catião, tendo-se apenas obtido aumento da estabilidade térmica do RNA com o IL [N1111]Cl. Por fim, e de forma a averiguar a toxicidade dos suportes e dos ILs análogos, foram realizados ensaios de citotoxicidade numa linha celular humana, em que os materiais e ILs foram colocados em contacto com as células até um período de tempo de 48 horas. Verificou-se que os suportes com os ILs imobilizados na superfície não demonstraram qualquer toxicidade para estas células, ao contrário do observado com os ILs análogos aos usados nos suportes. Estes demonstraram significativa toxicidade, que também se verificou ser dependente do tamanho das cadeias carbonadas e da concentração de IL aplicada, apresentando assim uma vantagem dos ILs imobilizados em suportes, comparativamente ao uso de ILs no estado líquido. Desta forma, foi possível demonstrar a importância de vários ILs na purificação e estabilização dos ácidos nucleicos, tratando-se de uma área em constante crescimento.
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Keywords
Cromatografia Estabilidade de Rna Líquidos Iónicos Purificação de Ácidos Nucleicos