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Abstract(s)
Currently, the metalloprotease "A disintegrin and metalloproteinase 17" (ADAM17) has
been gaining prominence due to its important action in signalling pathways where the
soluble interleukin receptor - 6 (sIL-6R), the epidermal growth factor receptor (EGF-R)
and the tumour necrosis factor alfa receptor (TNF-aR) participate, establishing ADAM17
as an attractive target in cancer therapy and infectious diseases. Thus, due to the high
specificity of antibodies to recognize a particular epitope, it was possible to develop an
anti-ADAM17 antibody, named MEDI3622, which has been shown to have the ability to
specifically block the activity of ADAM17. Furthermore, the messenger Ribonucleic Acid
(mRNA) has been showing great potential and applicability in several areas, namely in
passive immunization, by the in vivo expression of antibodies, making mRNA a highly
attractive method. Thus, in the present work, an mRNA sequence was prepared with the
coding sequence of MEDI3622 for expression of this anti-ADAM17 antibody.
Therefore, given the great therapeutic potential of mRNA, the high demand from the
biopharmaceutical industry and the need to obtain it in a stable and pure form, it is
important to optimize the production and purification processes of this biomolecule. The
cryogels have emerged as a new alternative to conventional particulate chromatographic
media for the purification of high molecular weight molecules, and their potential has
already been demonstrated in the purification of the supercoiled isoform of plasmidic
deoxyribonucleic acid (pDNA). Cryogels also have a supermacroporous structure that
allows for facilitated diffusion, high flow rates, and high capacity. Currently, the strategy
of choice for mRNA purification is affinity chromatography, using nucleotides as ligands,
whose adenine and thymine base pairing specificity promotes highly selective and
specific interactions.
Thus, the aim of this work was to synthesize thymine-functionalized cryogels to purify
the mRNA sequence produced by in vitro transcription, that encodes the anti-ADAM17
antibody MEDI3622. To this end, the ligand 1-(2-propenyl) thymine (ProT) was
synthesized and characterized by nuclear magnetic resonance (NMR), the cryogels were
subsequently prepared based on the monomer 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), by
copolymerization of the monomers HEMA and ProT, with different mass ratios of ProT
and subjected to cryogenic treatment. The cryogels were characterized by scanning
electron microscopy (SEM), energy dispersive X-ray analysis (EDXA), and rehydration
capacity tests. Subsequently, to evaluate the behaviour of poly-thymine cryogels, purification tests were first performed under different conditions, varying the ionic
strength, the type of salt (sodium chloride (NaCl) or ammonium sulphate ((NH4)2SO4))
and the pH in the mobile phase, taking advantage of the affinity between ProT ligands
and adenines present in low molecular weight RNA (LMW RNA) used as a model sample,
aiming to identify the best conditions under which binding and elution occurred. In the
second phase, having already optimized the binding and elution conditions, the ability of
cryogels to purify the mRNA was tested. In this phase, the NaCl concentration in the
elution buffers was varied in order to achieve the separation between mRNA and pDNA
used for its production.
As the main results, the synthesis of the ligand 1-(2-propenyl) thymine was successfully
achieved. Furthermore, in this task, it was also possible to isolate the unreacted thymine
and a by-product of the reaction in which di-alkylation of thymine occurred (1,3-bis(2-
propenyl) thymine). The fact that it was possible to isolate these two compounds makes
the present work fit in with the principles of circular economy, reducing the costs of the
synthesis of the ligand by reusing the isolated thymine, while eliminating the waste of
by-products by the possibility of using di-alkylated thymine as a cross-linking agent
instead of N, N'-Methylenebisacrylamide. However, traces of a second by-product (3-(2-
propenyl) thymine) were found, and it was not possible to fully isolate the ligand of
interest due to its structural similarity to this by-product, thus the isolation step needs
to be optimized in the future.
Regarding the characterization of the cryogels, the functionalized ones did not show
significant changes in rehydration capacity compared to the non-functionalized one.
Differences in morphology were visualized, which may denote the presence of the ligand
in the polymeric matrix of the cryogels. Also, they may have resulted from the conditions
used in the synthesis process of cryogels. Furthermore, through the EDXA, it was
possible to confirm that there was functionalization of the cryogels, however, this method
is not the most indicated for this type of confirmation, other methods, such as elemental
analysis and solid-state NMR, can be used in the future to corroborate the results at the
functionalization level.
The results of the chromatographic assays demonstrate that the ProT functionalized
cryogels were able to bind and elute mRNA and pDNA. Moreover, they showed potential
to separate pDNA and mRNA, demonstrating a higher affinity for mRNA. The control
cryogel (with no ProT ligand incorporated) also demonstrated the ability to bind and
elute both mRNA and pDNA, however, it showed no aptitude to separate these two biomolecules. Thus, ProT functionalized cryogels appear to be a novel approach to
overcoming challenges in mRNA purification.
A metaloprotease “A Desintegrin And Metalloproteinase 17” (ADAM17) tem vindo a ganhar destaque devido à sua importante ação nas vias de sinalização onde participa, particularmente na interação com o recetor solúvel da interleucina - 6 (soluble interleukin receptor – 6, sIL-6R), o recetor do fator de crescimento epidérmico (Epithermal Growth Factor Receptor, EGF-R) e o recetor do fator de necrose tumoral (Receptor of Tumour Necrosis Factor, TNF-aR), estabelecendo a ADAM17 como um alvo atrativo na terapêutica contra o cancro e doenças infeciosas. Assim, devido à grande especificidade dos anticorpos para reconhecer um determinado epítopo, foi possível desenvolver um anticorpo anti-ADAM17, denominado de MEDI3622, que demonstrou ter a habilidade de bloquear especificamente a atividade da ADAM17. Além disso, o ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) tem vindo a demonstrar grande potencial e aplicabilidade em diversas áreas, nomeadamente na imunização passiva, através da expressão in vivo de anticorpos. Deste modo, no presente trabalho foi preparado mRNA com a sequência codificante do MEDI3622 para expressão deste anticorpo antiADAM17. Assim, dado o grande potencial terapêutico do mRNA, a elevada procura por parte da indústria biofarmacêutica e a necessidade de ser obtido na forma estável e pura, tornase urgente otimizar os processos de produção e purificação desta biomolécula. Os criogeis surgiram como uma nova alternativa aos suportes cromatográficos particulados convencionais para a purificação de moléculas com elevado peso molecular, tendo já sido demonstrado o seu potencial na purificação da isoforma superenrolada do ácido desoxirribonucleico plasmídico (pDNA). Devido à sua estrutura supermacroporosa, os criogeis permitem difusão facilitada, altas taxas de fluxo e alta capacidade. Atualmente, a estratégia de eleição para a purificação do mRNA é a cromatografia de afinidade, através do uso de nucleótidos como ligandos, cuja especificidade do emparelhamento das bases adenina e timina promove interações altamente seletivas e específicas. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi sintetizar criogéis funcionalizados com timina, para purificar a sequência de mRNA produzida por transcrição in vitro que codifica o anticorpo anti-ADAM17, o MEDI3622. Para isso, o ligando 1-(2-propenil) Timina (ProT) foi sintetizado e caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN), sendo posteriormente preparados criogeis à base do monómero 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), por copolimerização dos monómeros HEMA e ProT, com diferentes proporções mássicas de ProT e submetidos a um tratamento criogénico. Os criogeis foram caracterizados por microscopia eletrónica de varrimento (scanning electron microscopy, SEM), análise de energia dispersiva de raios-X (energy dispersive X-ray analysis, EDXA), e testes de capacidade de reidratação. Posteriormente, para avaliação do comportamento dos criogeis poli-Timina, foram realizados ensaios de purificação em diferentes condições, variando a força iónica, o tipo de sal (cloreto de sódio (NaCl) ou sulfato de amónio ((NH4)2SO4)) e o pH na fase móvel, tirando partido da afinidade entre os ligandos ProT e as adeninas presentes em amostras de low molecular weight RNA (LMW RNA) como moléculas modelo, visando identificar as melhores condições em que ocorreria ligação e eluição. Numa segunda fase, após a otimização destas condições, testou-se a capacidade dos criogeis poli-Timina para purificar o mRNA, por variação da concentração de NaCl no eluente, de forma a promover a separação entre o mRNA e pDNA utilizado na sua produção. Como principais resultados, destaca-se a síntese do ligando 1-(2-propenil) timina que foi bem-sucedida. Além disso, nesta tarefa foi ainda possível isolar a timina que não reagiu e um subproduto da reação no qual ocorreu a di-alquilação da timina (1,3-bis(2-propenil) timina). O isolamento destes dois compostos mostra que o presente trabalho se enquadra nos princípios da economia circular, reduzindo os custos da síntese do ligando, permitindo a reutilização da timina, ao mesmo tempo que são eliminados desperdícios de subprodutos através da possibilidade do uso da timina di-alquilada como agente de reticulação, ao invés da N, N'-metilenobisacrilamida. Contudo, encontraram-se vestígios de um segundo subproduto (3-(2-propenil) timina), não tendo sido possível isolar totalmente o ligando de interesse devido à sua semelhança estrutural com este subproduto, sendo necessário otimizar o passo de isolamento no futuro. Relativamente à caracterização dos criogéis, observou-se que os suportes funcionalizados não apresentaram alterações significativas na capacidade de reidratação, em comparação com o não funcionalizado. Além disso, visualizaram-se diferenças ao nível da morfologia entre os criogéis poli-Timina e o controlo, podendo estar relacionadas com a presença do ligando na matriz polimérica dos criogéis. Estas diferenças podem, ainda, ter resultado das condições utilizadas no processo de síntese dos criogéis. Através de EDXA foi possível confirmar que houve funcionalização dos criogéis, contudo este método não é o mais indicado devido à sua limitada sensibilidade, sendo desejável a utilização de outros métodos, como análise elementar e RMN em estado-sólido, para confirmar os resultados ao nível da funcionalização. Os resultados dos ensaios cromatográficos demonstraram que os criogéis funcionalizados com ProT conseguiram ligar e eluir o mRNA e o pDNA, apresentando maior afinidade para o mRNA, e portanto, potencial para separar estas biomoléculas. O criogel de controlo também demonstrou capacidade para ligar e eluir tanto o mRNA como o pDNA, contudo não apresentou seletividade para separar estas duas biomoléculas. Assim, os criogeis funcionalizados com ProT parecem ser uma abordagem inovadora para superar alguns dos desafios na purificação do mRNA.
A metaloprotease “A Desintegrin And Metalloproteinase 17” (ADAM17) tem vindo a ganhar destaque devido à sua importante ação nas vias de sinalização onde participa, particularmente na interação com o recetor solúvel da interleucina - 6 (soluble interleukin receptor – 6, sIL-6R), o recetor do fator de crescimento epidérmico (Epithermal Growth Factor Receptor, EGF-R) e o recetor do fator de necrose tumoral (Receptor of Tumour Necrosis Factor, TNF-aR), estabelecendo a ADAM17 como um alvo atrativo na terapêutica contra o cancro e doenças infeciosas. Assim, devido à grande especificidade dos anticorpos para reconhecer um determinado epítopo, foi possível desenvolver um anticorpo anti-ADAM17, denominado de MEDI3622, que demonstrou ter a habilidade de bloquear especificamente a atividade da ADAM17. Além disso, o ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) tem vindo a demonstrar grande potencial e aplicabilidade em diversas áreas, nomeadamente na imunização passiva, através da expressão in vivo de anticorpos. Deste modo, no presente trabalho foi preparado mRNA com a sequência codificante do MEDI3622 para expressão deste anticorpo antiADAM17. Assim, dado o grande potencial terapêutico do mRNA, a elevada procura por parte da indústria biofarmacêutica e a necessidade de ser obtido na forma estável e pura, tornase urgente otimizar os processos de produção e purificação desta biomolécula. Os criogeis surgiram como uma nova alternativa aos suportes cromatográficos particulados convencionais para a purificação de moléculas com elevado peso molecular, tendo já sido demonstrado o seu potencial na purificação da isoforma superenrolada do ácido desoxirribonucleico plasmídico (pDNA). Devido à sua estrutura supermacroporosa, os criogeis permitem difusão facilitada, altas taxas de fluxo e alta capacidade. Atualmente, a estratégia de eleição para a purificação do mRNA é a cromatografia de afinidade, através do uso de nucleótidos como ligandos, cuja especificidade do emparelhamento das bases adenina e timina promove interações altamente seletivas e específicas. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi sintetizar criogéis funcionalizados com timina, para purificar a sequência de mRNA produzida por transcrição in vitro que codifica o anticorpo anti-ADAM17, o MEDI3622. Para isso, o ligando 1-(2-propenil) Timina (ProT) foi sintetizado e caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN), sendo posteriormente preparados criogeis à base do monómero 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), por copolimerização dos monómeros HEMA e ProT, com diferentes proporções mássicas de ProT e submetidos a um tratamento criogénico. Os criogeis foram caracterizados por microscopia eletrónica de varrimento (scanning electron microscopy, SEM), análise de energia dispersiva de raios-X (energy dispersive X-ray analysis, EDXA), e testes de capacidade de reidratação. Posteriormente, para avaliação do comportamento dos criogeis poli-Timina, foram realizados ensaios de purificação em diferentes condições, variando a força iónica, o tipo de sal (cloreto de sódio (NaCl) ou sulfato de amónio ((NH4)2SO4)) e o pH na fase móvel, tirando partido da afinidade entre os ligandos ProT e as adeninas presentes em amostras de low molecular weight RNA (LMW RNA) como moléculas modelo, visando identificar as melhores condições em que ocorreria ligação e eluição. Numa segunda fase, após a otimização destas condições, testou-se a capacidade dos criogeis poli-Timina para purificar o mRNA, por variação da concentração de NaCl no eluente, de forma a promover a separação entre o mRNA e pDNA utilizado na sua produção. Como principais resultados, destaca-se a síntese do ligando 1-(2-propenil) timina que foi bem-sucedida. Além disso, nesta tarefa foi ainda possível isolar a timina que não reagiu e um subproduto da reação no qual ocorreu a di-alquilação da timina (1,3-bis(2-propenil) timina). O isolamento destes dois compostos mostra que o presente trabalho se enquadra nos princípios da economia circular, reduzindo os custos da síntese do ligando, permitindo a reutilização da timina, ao mesmo tempo que são eliminados desperdícios de subprodutos através da possibilidade do uso da timina di-alquilada como agente de reticulação, ao invés da N, N'-metilenobisacrilamida. Contudo, encontraram-se vestígios de um segundo subproduto (3-(2-propenil) timina), não tendo sido possível isolar totalmente o ligando de interesse devido à sua semelhança estrutural com este subproduto, sendo necessário otimizar o passo de isolamento no futuro. Relativamente à caracterização dos criogéis, observou-se que os suportes funcionalizados não apresentaram alterações significativas na capacidade de reidratação, em comparação com o não funcionalizado. Além disso, visualizaram-se diferenças ao nível da morfologia entre os criogéis poli-Timina e o controlo, podendo estar relacionadas com a presença do ligando na matriz polimérica dos criogéis. Estas diferenças podem, ainda, ter resultado das condições utilizadas no processo de síntese dos criogéis. Através de EDXA foi possível confirmar que houve funcionalização dos criogéis, contudo este método não é o mais indicado devido à sua limitada sensibilidade, sendo desejável a utilização de outros métodos, como análise elementar e RMN em estado-sólido, para confirmar os resultados ao nível da funcionalização. Os resultados dos ensaios cromatográficos demonstraram que os criogéis funcionalizados com ProT conseguiram ligar e eluir o mRNA e o pDNA, apresentando maior afinidade para o mRNA, e portanto, potencial para separar estas biomoléculas. O criogel de controlo também demonstrou capacidade para ligar e eluir tanto o mRNA como o pDNA, contudo não apresentou seletividade para separar estas duas biomoléculas. Assim, os criogeis funcionalizados com ProT parecem ser uma abordagem inovadora para superar alguns dos desafios na purificação do mRNA.
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Adam17 Criogéis Cromatografia de Afinidade Medi3622 Mrna Timina