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Authors
Abstract(s)
Regardless of the advancements in medicine, there are diseases that have a tremendous impact on today’s society. In this context, cancer is probably the most devastating one. Despite all the intensive research on cancer, its incidence and mortality rates are still high. In fact, the classical cancer treatments (surgery, chemotherapy and radiotherapy) have a low therapeutic efficacy and induce side effects in patients that can pose a threat to their life. Furthermore, the low therapeutic index of the available treatments is further impaired by resistance mechanisms developed by cancer cells to drugs/radiation. On the other hand, the novel therapies that are under clinical investigation (e.g. targeted chemotherapy and immunotherapy) are also affected by resistance mechanisms and have an even higher cost to the health service providers. In this way, there is an urgent need to discover and implement innovative cancer treatments that possess a higher therapeutic efficacy and display fewer side-effects.
Among the different therapeutic approaches under investigation, photothermal therapy (PTT) mediated by nanomaterials has been showing promising results both in in vitro and in vivo assays. This therapy employs nanomaterials that, due to their physicochemical properties, can accumulate preferentially in the tumor site. Afterwards, an external light is used to irradiate the tumor zone, and the nanostructures accumulated at the tumor site absorb the radiation energy and convert it into heat, inducing damage to the cells. In nanomaterials’ mediated PTT, it is crucial to use near infrared radiation (NIR; 750-1000 nm) since most of the biological components (e.g. water, hemoglobin, proteins, melanin) have a minimal or an insignificant absorption within this wavelength range. Consequently, nanostructures should have a high NIR absorption in order to produce an efficient photothermal effect, when they are exposed to NIR light. In this way, compared to conventional therapies, cancer PTT mediated by nanomaterials can induce a spatial-temporal controlled effect with a higher selectivity towards the tumor zone.
Among the different light-responsive nanomaterials, graphene oxide (GO) reveals promising properties to be applied in cancer PTT. GO is a 2D nanomaterial composed by a graphitic lattice that contains several types of oxygen-functional groups (carboxyl, hydroxyl and epoxy). This nanomaterial absorbs in the NIR region, displaying an efficient photothermal capacity. Furthermore, the aromatic lattice of this nanomaterial allows the loading of different types of molecules through non-covalent interactions (hydrophobic-hydrophobic interactions and π-π stacking). In this way, GO has a tremendous potential for photothermal and drug delivery applications. However, the direct use of GO in cancer therapy is severely limited by different factors. Firstly, GO has a weak colloidal stability – it precipitates in saline solutions and in biological fluids. This factor limits its intravenous administration. Furthermore, the aromatic lattice of GO can adsorb complement proteins, leading to its recognition by macrophages, and subsequent clearance from blood circulation. This removal avoids nanomaterials’ accumulation in the tumor zone. Additionally, GO is not selectively internalized by cancer cells, and thus can mediate a therapeutic effect that also affects the healthy cells found within the tumor microenvironment.
The main objective of this thesis’ work plan was to address the limitations associated to GO-based materials and implement novel strategies to improve the PTT mediated by these materials. Such was pursued by i) employing coatings that can improve the biological performance of GO-based materials, ii) exploring preparation methods that can enhance GO photothermal capacity, and iii) encapsulating drug combinations with optimal synergistic anticancer activity on GO.
In the first study, the anticancer capacity of D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) functionalized GO-based materials was evaluated. Initially, graphite oxide was synthesized through a modified version of the improved Hummer’s method. This material was then base-washed to remove the oxidation debris from its structure, which can improve its ability to adsorb molecules. Then, the material was exfoliated, yielding nanosized base-washed GO (bwGO). Afterwards, TPGS was explored for the functionalization of bwGO through two different approaches: a simple sonication method (yielding TPGS/bwGO) and a one-pot hydrothermal treatment (yielding TPGS/htGO). The results revelated that the TPGS coating successfully improved the stability of the GO derivatives. In particular, the TPGS/htGO displayed a greater colloidal stability and a 1.9-times higher NIR absorption (at 808 nm) in comparison to TPGS/bwGO. In in vitro studies, the TPGS/GO derivatives reduced the viability of breast cancer cells and had an insignificant effect on healthy cells. Furthermore, the combined application of TPGS/GO derivatives and NIR light induced an improved therapeutic effect. Particularly, the enhanced optical properties of TPGS/htGO enabled it to mediate a slightly more efficient phototherapy.
In the second part of this thesis, the chemo-phototherapeutic potential of bwGO functionalized with an amphiphilic polymer based on poly(2-ethyl-2-oxazoline) (POxylated bwGO) and loaded with Doxorubicin (DOX) and D-α-Tocopherol succinate (TOS) was assessed. The results revealed that the POxylated bwGO presents suitable physicochemical, colloidal, optical and biological properties for application in cancer therapy. In addition, the screening of different DOX:TOS molar combination ratios, ranging from 5:1 to 1:5, disclosed that the 1:3 DOX:TOS molar ratio produces an optimal synergistic therapeutic effect towards breast cancer cells (combination index of about 0.56). Furthermore, this drug ratio had a 2-times weaker effect on normal cells. POxylated bwGO was then loaded with the 1:3 DOX:TOS combination in order to evaluate its chemo-phototherapeutic potential. In in vitro studies, the delivery of DOX:TOS by POxylated bwGO to cancer cells induced a stronger therapeutic effect than that attained with the free drug combination. Furthermore, an even greater cytotoxicity towards cancer cells was achieved by exposing DOX:TOS loaded POxylated bwGO to NIR radiation.
Overall, the obtained results demonstrate that the applicability of GO-based materials in cancer therapy can be improved by performing their functionalization with amphiphilic polymers. Furthermore, the therapeutic potential of GO derivatives can be enhanced by using coatings with intrinsic anticancer activity or by encapsulating drugs that display a higher effect on cancer cells. These novel strategies will further contribute for the translation of GO-based materials from the bench to the bedside.
A sociedade atual é profundamente afetada por diversas doenças, sendo o cancro uma das mais devastadoras. Apesar de toda a investigação desenvolvida em torno do cancro, as taxas de incidência e de mortalidade associadas a esta doença continuam muito elevadas. Esta realidade está em parte relacionada com as limitações dos tratamentos disponíveis para o cancro, que incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Estas terapias são caracterizadas por apresentarem uma baixa eficácia terapêutica e por causarem efeitos secundários nos pacientes. Para além disto, a eficácia destes tratamentos é ainda diminuída por mecanismos de resistência a fármacos/radiação desenvolvidos pelas células cancerígenas. Por outro lado, as novas terapias que estão a ser testadas em meio clínico (ex.: imunoterapia e quimioterapia direcionada) também são afetadas por mecanismos de resistência e acarretam custos superiores para o Serviço Nacional de Saúde. Desta forma, existe uma necessidade premente de desenvolver e implementar tratamentos inovadores para o cancro, que apresentem maior eficácia sem, no entanto, induzirem efeitos secundários significativos. De entre as numerosas abordagens terapêuticas em investigação, a terapia fototérmica (PTT) mediada por nanomateriais tem demonstrado resultados promissores nos ensaios pré-clínicos. Esta abordagem explora a utilização de nanomateriais, que devido às suas propriedades físico-químicas, conseguem acumular-se preferencialmente no local do tumor. Posteriormente, a zona do tumor é irradiada com um feixe de luz, e os nanomateriais acumulados nesta zona absorvem-na e convertem-na em calor, induzindo assim danos nas células cancerígenas. Na PTT mediada por nanomateriais é fundamental usar uma radiação com um comprimento de onda na região do infravermelho próximo (NIR; 750-1000 nm) uma vez que os principais componentes biológicos (ex.: água, hemoglobina, proteínas, melanina) têm uma absorção mínima ou insignificante nesta gama de comprimentos de onda. Devido a este facto, as nanoestruturas projetadas para utilização na PTT devem ter uma elevada absorção no NIR de modo a conseguirem produzir um efeito fototérmico, que induza citotoxicidade para as células cancerígenas. Assim, comparativamente com as terapias convencionais, a PTT mediada por nanomateriais pode induzir um efeito espácio-temporal controlado, permitindo-lhe atingir uma maior seletividade para a zona do tumor. De entre os diferentes nanomateriais responsivos à luz, o óxido de grafeno (GO) tem revelado propriedades promissoras para aplicação na PTT do cancro. O GO é um nanomaterial composto por uma matriz de grafite, que contém diversos tipos de grupos funcionais (carboxílico, hidroxilo e epóxi). Este nanomaterial absorve na região do NIR, apresentando uma capacidade fototérmica eficiente. Para além disto, os seus grupos aromáticos permitem o encapsulamento de diversas moléculas na sua estrutura através de interações não covalentes (interações hidrofóbicas e empilhamento π-π). Assim, o GO tem um elevado potencial para aplicações fototérmicas e de entrega de fármacos. Porém, a aplicação direta do GO na terapia do cancro é severamente limitada pela sua baixa estabilidade coloidal, o que faz com que este nanomaterial precipite em soluções salinas e em fluídos biológicos. Este fator limita assim a sua administração intravenosa. Para além disto, a matriz aromática do GO pode adsorver moléculas do sistema complemento e este nanomaterial pode ser reconhecido por macrófagos. Estes eventos induzem a rápida eliminação do GO, diminuindo a probabilidade deste se acumular na zona do tumor. Finalmente, o GO não é seletivamente internalizado pelas células cancerígenas e, portanto, pode afetar as células saudáveis que se encontram no microambiente tumoral. As estratégias que permitam ultrapassar estas limitações irão certamente contribuir para incrementar a aplicabilidade e a capacidade terapêutica dos materiais à base de GO. Tendo em consideração as limitações do GO, o principal objetivo do plano de trabalhos desenvolvido nesta tese foi implementar novas estratégias para melhorar a PTT mediada por nanomateriais à base de GO. Para tal, procurou-se i) implementar revestimentos com capacidade de melhorar a performance biológica do GO, ii) explorar métodos de preparação capazes de aumentar a capacidade fototérmica do GO, e iii) encapsular combinações de fármacos com atividade anticancerígena sinérgica na matriz do GO. No primeiro estudo apresentado nesta tese, foi avaliada a capacidade terapêutica de materiais à base de GO funcionalizados com succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol 1000 (TPGS). Inicialmente, o óxido de grafite foi sintetizado usando uma versão modificada do método de Hummer’s melhorado. Seguidamente, este material sofreu um tratamento alcalino, com o intuito de remover os detritos da oxidação (o que pode melhorar a sua capacidade para adsorver moléculas), e foi posteriormente exfoliado de forma a obter o GO com dimensões nanométricas (bwGO). De seguida, foram exploradas duas abordagens diferentes para funcionalizar o bwGO com TPGS: um processo de sonicação simples (obtendo-se TPGS/bwGO) e um tratamento hidrotérmico (obtendo-se TPGS/htGO). Os resultados obtidos demonstraram que os nanomateriais revestidos com TPGS apresentam uma maior estabilidade coloidal. Em particular, o TPGS/htGO demonstrou possuir uma estabilidade coloidal superior e cerca de 1,9 vezes maior absorção no NIR (a 808 nm), quando comparado com o TPGS/bwGO. Após a sua irradiação com luz NIR, o TPGS/htGO induziu uma variação de temperatura 1,4 a 1,6 vezes superior àquela que é induzida pelo TPGS/bwGO. Nos estudos in vitro, os nanomateriais funcionalizados com TPGS reduziram a viabilidade das células do cancro da mama, e não tiveram um efeito citotóxico considerável nas células saudáveis. Para além disto, a combinação da luz NIR com os derivados de GO funcionalizados com TPGS promoveu um efeito terapêutico ainda mais acentuado. Neste ensaio, o TPGS/htGO mediou uma fototerapia ligeiramente mais eficaz devido às suas propriedades óticas melhoradas. No segundo estudo apresentado nesta tese, foi avaliado o potencial quimio-fototerapêutico do bwGO funcionalizado na sua superfície com um polímero anfifílico baseado em poli(2-etil-2-oxazolina) (bwGO POxilado) e que tinha incorporado na sua matriz a combinação de fármacos Doxorrubicina (DOX) e Succinato de D-α-tocoferol (TOS). Os resultados obtidos demonstraram que o bwGO POxilado apresenta propriedades físico-químicas, coloidais, óticas e biológicas adequadas para a sua aplicação na terapia do cancro. Para além disto, a análise da eficácia de diferentes combinações molares de DOX:TOS, de 5:1 a 1:5, revelou que o rácio molar 1:3 de DOX:TOS produz um efeito terapêutico sinérgico ótimo nas células do cancro da mama. Este rácio de fármacos demonstrou ainda um efeito cerca de 2 vezes inferior nas células saudáveis. Com base nestes resultados, a combinação molar 1:3 DOX:TOS foi selecionada para encapsulação no bwGO POxilado, com o objetivo de avaliar o potencial quimio-fototerapêutico deste. Nos estudos in vitro, a entrega de DOX:TOS pelo bwGO POxilado às células cancerígenas induziu um efeito terapêutico superior àquele que é obtido com a combinação dos fármacos na sua forma livre. Para além disto, a exposição do bwGO POxilado carregado com a combinação DOX:TOS à luz NIR induziu um maior efeito citotóxico nas células cancerígenas. Em suma, os resultados obtidos nestes estudos demonstraram que a aplicabilidade dos materiais à base de GO na terapia do cancro pode ser melhorada através da funcionalização deste com polímeros anfifílicos. Para além disto, o potencial terapêutico dos derivados de GO pode ser melhorado através do uso de revestimentos com atividade anticancerígena intrínseca, ou através da co-encapsulação de fármacos com um efeito citotóxico maior para as células cancerígenas. Estudos pré-clínicos mais aprofundados destes nanomateriais poderão conduzir à sua avaliação em ensaios clínicos.
A sociedade atual é profundamente afetada por diversas doenças, sendo o cancro uma das mais devastadoras. Apesar de toda a investigação desenvolvida em torno do cancro, as taxas de incidência e de mortalidade associadas a esta doença continuam muito elevadas. Esta realidade está em parte relacionada com as limitações dos tratamentos disponíveis para o cancro, que incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Estas terapias são caracterizadas por apresentarem uma baixa eficácia terapêutica e por causarem efeitos secundários nos pacientes. Para além disto, a eficácia destes tratamentos é ainda diminuída por mecanismos de resistência a fármacos/radiação desenvolvidos pelas células cancerígenas. Por outro lado, as novas terapias que estão a ser testadas em meio clínico (ex.: imunoterapia e quimioterapia direcionada) também são afetadas por mecanismos de resistência e acarretam custos superiores para o Serviço Nacional de Saúde. Desta forma, existe uma necessidade premente de desenvolver e implementar tratamentos inovadores para o cancro, que apresentem maior eficácia sem, no entanto, induzirem efeitos secundários significativos. De entre as numerosas abordagens terapêuticas em investigação, a terapia fototérmica (PTT) mediada por nanomateriais tem demonstrado resultados promissores nos ensaios pré-clínicos. Esta abordagem explora a utilização de nanomateriais, que devido às suas propriedades físico-químicas, conseguem acumular-se preferencialmente no local do tumor. Posteriormente, a zona do tumor é irradiada com um feixe de luz, e os nanomateriais acumulados nesta zona absorvem-na e convertem-na em calor, induzindo assim danos nas células cancerígenas. Na PTT mediada por nanomateriais é fundamental usar uma radiação com um comprimento de onda na região do infravermelho próximo (NIR; 750-1000 nm) uma vez que os principais componentes biológicos (ex.: água, hemoglobina, proteínas, melanina) têm uma absorção mínima ou insignificante nesta gama de comprimentos de onda. Devido a este facto, as nanoestruturas projetadas para utilização na PTT devem ter uma elevada absorção no NIR de modo a conseguirem produzir um efeito fototérmico, que induza citotoxicidade para as células cancerígenas. Assim, comparativamente com as terapias convencionais, a PTT mediada por nanomateriais pode induzir um efeito espácio-temporal controlado, permitindo-lhe atingir uma maior seletividade para a zona do tumor. De entre os diferentes nanomateriais responsivos à luz, o óxido de grafeno (GO) tem revelado propriedades promissoras para aplicação na PTT do cancro. O GO é um nanomaterial composto por uma matriz de grafite, que contém diversos tipos de grupos funcionais (carboxílico, hidroxilo e epóxi). Este nanomaterial absorve na região do NIR, apresentando uma capacidade fototérmica eficiente. Para além disto, os seus grupos aromáticos permitem o encapsulamento de diversas moléculas na sua estrutura através de interações não covalentes (interações hidrofóbicas e empilhamento π-π). Assim, o GO tem um elevado potencial para aplicações fototérmicas e de entrega de fármacos. Porém, a aplicação direta do GO na terapia do cancro é severamente limitada pela sua baixa estabilidade coloidal, o que faz com que este nanomaterial precipite em soluções salinas e em fluídos biológicos. Este fator limita assim a sua administração intravenosa. Para além disto, a matriz aromática do GO pode adsorver moléculas do sistema complemento e este nanomaterial pode ser reconhecido por macrófagos. Estes eventos induzem a rápida eliminação do GO, diminuindo a probabilidade deste se acumular na zona do tumor. Finalmente, o GO não é seletivamente internalizado pelas células cancerígenas e, portanto, pode afetar as células saudáveis que se encontram no microambiente tumoral. As estratégias que permitam ultrapassar estas limitações irão certamente contribuir para incrementar a aplicabilidade e a capacidade terapêutica dos materiais à base de GO. Tendo em consideração as limitações do GO, o principal objetivo do plano de trabalhos desenvolvido nesta tese foi implementar novas estratégias para melhorar a PTT mediada por nanomateriais à base de GO. Para tal, procurou-se i) implementar revestimentos com capacidade de melhorar a performance biológica do GO, ii) explorar métodos de preparação capazes de aumentar a capacidade fototérmica do GO, e iii) encapsular combinações de fármacos com atividade anticancerígena sinérgica na matriz do GO. No primeiro estudo apresentado nesta tese, foi avaliada a capacidade terapêutica de materiais à base de GO funcionalizados com succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol 1000 (TPGS). Inicialmente, o óxido de grafite foi sintetizado usando uma versão modificada do método de Hummer’s melhorado. Seguidamente, este material sofreu um tratamento alcalino, com o intuito de remover os detritos da oxidação (o que pode melhorar a sua capacidade para adsorver moléculas), e foi posteriormente exfoliado de forma a obter o GO com dimensões nanométricas (bwGO). De seguida, foram exploradas duas abordagens diferentes para funcionalizar o bwGO com TPGS: um processo de sonicação simples (obtendo-se TPGS/bwGO) e um tratamento hidrotérmico (obtendo-se TPGS/htGO). Os resultados obtidos demonstraram que os nanomateriais revestidos com TPGS apresentam uma maior estabilidade coloidal. Em particular, o TPGS/htGO demonstrou possuir uma estabilidade coloidal superior e cerca de 1,9 vezes maior absorção no NIR (a 808 nm), quando comparado com o TPGS/bwGO. Após a sua irradiação com luz NIR, o TPGS/htGO induziu uma variação de temperatura 1,4 a 1,6 vezes superior àquela que é induzida pelo TPGS/bwGO. Nos estudos in vitro, os nanomateriais funcionalizados com TPGS reduziram a viabilidade das células do cancro da mama, e não tiveram um efeito citotóxico considerável nas células saudáveis. Para além disto, a combinação da luz NIR com os derivados de GO funcionalizados com TPGS promoveu um efeito terapêutico ainda mais acentuado. Neste ensaio, o TPGS/htGO mediou uma fototerapia ligeiramente mais eficaz devido às suas propriedades óticas melhoradas. No segundo estudo apresentado nesta tese, foi avaliado o potencial quimio-fototerapêutico do bwGO funcionalizado na sua superfície com um polímero anfifílico baseado em poli(2-etil-2-oxazolina) (bwGO POxilado) e que tinha incorporado na sua matriz a combinação de fármacos Doxorrubicina (DOX) e Succinato de D-α-tocoferol (TOS). Os resultados obtidos demonstraram que o bwGO POxilado apresenta propriedades físico-químicas, coloidais, óticas e biológicas adequadas para a sua aplicação na terapia do cancro. Para além disto, a análise da eficácia de diferentes combinações molares de DOX:TOS, de 5:1 a 1:5, revelou que o rácio molar 1:3 de DOX:TOS produz um efeito terapêutico sinérgico ótimo nas células do cancro da mama. Este rácio de fármacos demonstrou ainda um efeito cerca de 2 vezes inferior nas células saudáveis. Com base nestes resultados, a combinação molar 1:3 DOX:TOS foi selecionada para encapsulação no bwGO POxilado, com o objetivo de avaliar o potencial quimio-fototerapêutico deste. Nos estudos in vitro, a entrega de DOX:TOS pelo bwGO POxilado às células cancerígenas induziu um efeito terapêutico superior àquele que é obtido com a combinação dos fármacos na sua forma livre. Para além disto, a exposição do bwGO POxilado carregado com a combinação DOX:TOS à luz NIR induziu um maior efeito citotóxico nas células cancerígenas. Em suma, os resultados obtidos nestes estudos demonstraram que a aplicabilidade dos materiais à base de GO na terapia do cancro pode ser melhorada através da funcionalização deste com polímeros anfifílicos. Para além disto, o potencial terapêutico dos derivados de GO pode ser melhorado através do uso de revestimentos com atividade anticancerígena intrínseca, ou através da co-encapsulação de fármacos com um efeito citotóxico maior para as células cancerígenas. Estudos pré-clínicos mais aprofundados destes nanomateriais poderão conduzir à sua avaliação em ensaios clínicos.
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Cancro - Terapia Fototérmica Infravermelho Próximo Nanomateriais Óxido de Grafeno