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Biorecognition by amino acid-based affinity chromatography for RNA purification
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Following the decoding of the human genome, a new era was opened for developing new gene therapy strategies employing nucleic acids. Recently, RNA was renowned a central molecule in cellular processes with implications in many diseases as well as in understanding of evolution, becoming one of the most exciting research areas of molecular biology. From basic to applied research, many procedures employ pure and intact RNA molecules. On one hand, RNA purification is a first critical step of a number of molecular biology procedures and its quality is crucial to ensure reproducibility and biological relevance of an experiment. On the other hand, the promising and revolutionary RNA-based therapies of RNA vaccination, gene therapy or recombinant biopharmaceuticals involves RNA formulations which should fulfill rigorous quality criteria recommended by international regulatory agencies. However, the isolation and purification of RNA are critical steps because of the easy degradability of RNA, which can impair chemical stability and biological functionality essential for analysis. Many techniques have been development to overcome the challenges of purifying RNA molecules; nonetheless they still have several limitations in regard to time demanding and the requirement of toxic solvents and denaturing conditions. Therefore, there is a growing demand for the evaluation and improvement of the methodologies currently used for RNA isolation and purification. Chromatography is undoubtedly one of the most diverse and potent methods in biotechnology, both at analytical, preparative and industrial level due to its simplicity, robustness, versatility and high reproducibility. Affinity chromatography is recognized as a powerful technique with great applicability in the purification of many biomolecules, including plasmid DNA and proteins because it exploits the principle of biomolecular recognition. The work that we have been developing considers new chromatographic strategies for RNA purification, using amino acids as affinity ligands. These studies are based on the fact that many different interactions exist between proteins and nucleic acids in biological systems, involving in particular basic amino acids such as histidine or arginine. New methodologies were accomplished that allowed obtaining RNA preparations from different sources with high recovery yields, purity and integrity. A new analytical method for RNA quantification was also developed in this work. The applicability of histidine-based affinity chromatography in the purification of RNA molecules was first demonstrated in the separation of 6S RNA, a regulatory non-coding RNA of the prokaryotic Escherichia coli (E.coli). A specific recognition between the histidine support and 6S RNA allowed its selective purification from a complex mixture of other small RNAs (sRNA). In another strategy, the simultaneous isolation of sRNA and ribosomal RNA from E.coli cell lysates, eliminating host DNA and proteins, was also attained by a histidine chromatographic-based method. Furthermore, arginine matrix was employed in RNA purification from eukaryotic cells demonstrating an exceptional ability to interact with all functional classes of RNA, despite their structural diversity and different folding states, enabling their isolation from impurities of eukaryotic crude cell extracts. Moreover, an analytical technique based on arginine affinity support for quantification and quality assessment of total RNA from different eukaryotic cells and synthetic RNA samples was also developed and validated, according to international and European legislation for bioanalytical methods. More efforts into RNA purification were developed with amino acid-based matrices, in particular with arginine-agarose matrix, in order to approach this technique to therapeutic application of RNA. The new goal was to exploit its applicability in purifying messenger RNA (mRNA) molecules not from cells, but from synthetic crudes of in vitro transcription reactions, pursuing mRNA vaccination for cervical cancer. In this work, arginine-based chromatography also showed its singular capability to improve purification processes, showing the advantages of eliminating additional steps and improving global economics of the production process. The development of these new methodologies revealed several interesting characteristics of RNA molecules, including their chromatographic behavior and natural interactions that can occur between amino acids-based supports and RNA molecules. Accordingly, these methods demonstrated a potential multipurpose applicability by aiding in molecular biology RNA-based analysis and RNA therapeutics, which support the interest in applying amino acid-based affinity chromatography for the future development of new RNA isolation, purification and quantification processes.
A sequenciação completa do genoma humano ofereceu novos horizontes relativamente à prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças humanas. Para além disso, com o avanço da engenharia genética, têm surgido novas tecnologias terapêuticas, entre as quais se destacam a terapia génica utilizando ácidos nucleicos. Apesar destas estratégias génicas se terem iniciado com o DNA (ácido desoxirribonucleico), estudos recentes têm avaliado o potencial interesse terapêutico do RNA (ácido ribonucleico). O RNA foi recentemente reconhecido como uma molécula fundamental nos processos celulares, com implicações fundamentais na evolução dos organismos, na hereditariedade e na regulação de vários genes, o que destacou o seu vasto potencial terapêutico e conduziu ao aparecimento de várias terapias baseadas em moléculas de RNA. Os resultados promissores dessas novas abordagens terapêuticas têm vindo a reforçar a investigação relacionada com as moléculas de RNA, a avaliar pelo número, cada vez mais elevado, de estudos estruturais, biofísicos e biomédicos presentes na literatura. Além disso, a indústria biotecnológica e farmacêutica começam a visar as moléculas de RNA como uma nova classe de produtos bioterapêuticos. Um requisito fundamental em todos esses estudos é a obtenção de grandes quantidades de RNA isolado e puro e de integridade assegurada. Como por exemplo, em biologia molecular a purificação de RNA é o primeiro passo chave para avaliar a expressão de um gene, uma vez que a realização bem como a reprodutibilidade e relevância biológica dessa experiência está dependente da quantidade e qualidade das preparações de RNA. Por outro lado, as terapias promissoras e revolucionárias baseadas em RNA, como a vacinação ou utilização de biofármacos recombinantes envolvem formulações de RNA que devem satisfazer critérios de qualidade rigorosos recomendados por agências reguladoras internacionais. No entanto, o processo de purificação das moléculas de RNA pode ser um passo bastante limitante para o sucesso da sua aplicação terapêutica. O RNA tem uma série de características químicas únicas que se reflectem na sua conformação estrutural. Apesar do RNA ser uma molécula de cadeia simples na sua base, ele tem uma elevada propensão para formar estruturas secundárias e terciárias bastante complexas. São estas compactações próprias das moléculas de RNA que definem as suas importantes funções biológicas. A elevada reactividade química é outra característica própria do RNA e com grande relevância biológica a nível regulatório, por proporcionar mais instabilidade à molécula aumentando a sua susceptibilidade à degradação. Num contexto laboratorial, estas características moleculares do RNA são enormes desafios para a sua extracção e purificação, pois a sua actividade biológica e integridade podem ser facilmente comprometidas durante os procedimentos devido à presença ubíqua de enzimas que o degradam. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para superar os desafios inerentes ao isolamento e purificação de moléculas de RNA, tais como a extracção com fenol e clorofórmio ou as extracções em fase sólida empregando colunas ou esferas de sílica (SPE), bem como algumas técnicas de purificação com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa e troca iónica. No entanto, estas ainda apresentam várias limitações nomeadamente em relação ao elevado tempo despendido e à necessidade do uso de solventes tóxicos e condições desnaturantes durante os procedimentos. Por todos estes motivos, torna-se evidente o crescente interesse na avaliação e melhoria das metodologias actualmente utilizadas para o isolamento e purificação de RNA de modo a satisfazer os requisitos necessários à sua aplicação. A cromatografia é um dos métodos mais diversos e potentes em biotecnologia, tanto a nível analítico como preparativo devido à sua simplicidade, robustez, versatilidade e alta reprodutibilidade. Por sua vez, a cromatografia de afinidade é reconhecida como uma técnica poderosa apresentando grande aplicabilidade na purificação de muitas biomoléculas, incluindo o DNA plasmídico (pDNA) e proteínas, porque explora o reconhecimento biomolecular, ou seja, a capacidade de uma macromolécula biologicamente activa formar complexos específicos e reversíveis com ligandos de afinidade. Posto isto, o trabalho desenvolvido no âmbito desta tese incide na crescente necessidade de desenvolver novas estratégias de isolamento e purificação para moléculas de RNA de modo a ultrapassar as limitações ainda existentes nas metodologias actuais, contribuindo para a evolução e sucesso da investigação e aplicações terapêuticas do RNA. Para isso, a potencialidade da cromatografia de afinidade foi considerada nesta temática e foi explorada a aplicação de aminoácidos como ligandos de afinidade. Este trabalho foi baseado em vários estudos de reconhecimento molecular e atómico que descrevem a existência de diferentes interacções entre proteínas e ácidos nucleicos nos sistemas biológicos, especialmente com aminoácidos básicos como a histidina e a arginina, e também na hipótese de existirem interacções preferenciais entre os aminoácidos e as bases nucleotídicas. Além disso, estudos recentes de processos de purificação mostraram grande aplicabilidade destes aminoácidos em isolar e purificar moléculas de pDNA biologicamente activas para aplicação em terapia génica e vacinas. Assim sendo, novas metodologias preparativas e analíticas foram alcançadas ao longo deste trabalho, ou seja, foi possível obter preparações de RNA a partir de diferentes fontes biológicas e de reacções sintéticas com elevados rendimentos e grau de pureza e de integridade preservada, bem como também foi possível o desenvolvimento de um método analítico para a sua quantificação e monitorização. A potencial aplicabilidade da cromatografia de afinidade, usando histidina como ligando de afinidade, na purificação de moléculas de RNA foi demonstrada pela primeira vez com a purificação do RNA 6S, um RNA regulatório não codificante presente nos procariotas, nomeadamente em Escherichia coli (E. coli), que tem uma função reguladora importante no processo de transcrição deste organismo. Nas estratégias de purificação com histidina foram usados gradientes de sulfato de amónio devido à presença do anel de imidazol na cadeia lateral aromática do aminoácido, o que permitiria explorar interacções maioritariamente hidrofóbicas entre o RNA e a matriz, quer por interacção com o anel ou por pontes de hidrogénio. Assim, foi utilizado um gradiente decrescente em concentração de sulfato de amónio em três etapas que revelou um reconhecimento bioespecífico com RNA 6S, permitindo a sua purificação de uma mistura complexa de outras moléculas de RNA de baixo peso molecular (sRNA). Uma segunda nova estratégia desenvolvida com a matriz de histidina permitiu obter simultaneamente o isolamento e purificação das classes de sRNA e RNA ribossómico (rRNA) a partir de lisados celulares de E. coli. Neste estudo, ambas as classes foram separadas das impurezas do hospedeiro (DNA genómico e proteínas) com elevado rendimento e grau de pureza quando comparadas com amostras preparadas com métodos de isolamento convencionais baseados na extracção com fenol e clorofórmio. No entanto, a metodologia baseada na cromatografia com histidina demonstrou a vantagem de evitar o uso de produtos químicos tóxicos durante o processo. A versatilidade da matriz de histidina na purificação de RNA, tanto de moléculas específicas (RNA 6S) como das classes (sRNA e rRNA) sugeriu que o mecanismo de interacção envolveria não só interacções hidrofóbicas, mas também um bioreconhecimento das bases do RNA pela histidina. Apesar das preparações de RNA obtidas com estes métodos necessitarem de caracterização funcional adicional para provar a sua aplicabilidade, o uso da cromatografia de afinidade com histidina representa um grande avanço no isolamento de moléculas de RNA, uma vez que as técnicas tradicionais não têm a capacidade de fraccionar RNA ao nível de um tipo de molécula ou de isolar sRNA e rRNA num só processo. Todavia, a necessidade de aplicar elevadas concentrações de sal nestas metodologias pode ser visto como uma desvantagem, principalmente no que diz respeito à aplicação biotecnológica, pois acarreta maiores custos de processo e tem maior impacto ambiental. O uso de arginina como aminoácido imobilizado na cromatografia de afinidade foi utilizado na perspectiva de melhorar as técnicas anteriores uma vez que este aminoácido se apresenta sobretudo carregado positivamente, pelo que poderiam ser exploradas interacções electrostáticas para a purificação de RNA utilizando condições de eluição moderadas. Além disso, as interacções de arginina têm sido reconhecidas como as mais prevalentes nos complexos RNA-proteína, aumentando a potencialidade de purificação por um maior bioreconhecimento entre as moléculas de RNA e a matriz de arginina. Deste modo, um gradiente com o aumento gradual da concentração de cloreto de sódio permitiu o isolamento e purificação do RNA total de extractos celulares eucarióticas. O suporte de arginina demonstrou uma aplicabilidade excepcional para interagir com todas as classes funcionais do RNA apesar da sua diversidade estrutural e as suas diferentes conformações em condições nativas. Essas interacções mais fortes e selectivas parecem advir da cadeia lateral do aminoácido de arginina que apresenta uma multiplicidade para interacções, podendo promover um contacto múltiplo com o RNA, através da sua estrutura açúcar-fosfato ou com as suas bases, atendendo ao seu estado conformacional. Embora as interacções electrostáticas entre os grupos fosfato do RNA e os ligandos de arginina possam desempenhar uma função importante na retenção do RNA na coluna, as interacções com as bases também estão envolvidas e modulam de alguma forma a interacção favorecida e a especificidade encontradas na cromatografia com arginina. Assim, neste processo de purificação verificou-se um elevado rendimento de recuperação do RNA total e pelas análises de controlo de qualidade efectuadas mostrou-se que este apresentava uma elevada integridade bem como uma boa pureza, demonstrada pela difícil detecção de proteínas nas amostras purificadas e pela redução de DNA genómico para concentrações residuais. A eficiência desta técnica de purificação e a aplicabilidade do RNA por ela obtido foi demonstrada num procedimento habitualmente usado em biologia molecular para a análise de expressão génica. As amostras de RNA total foram usadas com sucesso como moldes na reacção em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a avaliação da expressão de dois genes controlo geralmente empregues nestes procedimentos. Reunindo os resultados anteriormente descritos, o isolamento e purificação de RNA de amostras biológicas complexas usando as técnicas de cromatografia de afinidade com aminoácidos imobilizados demostrou vários benefícios em relação a métodos de isolamento actualmente empregues, como a extracção de fenol e clorofórmio ou de SPE, uma vez que simplificam a integração do processo e minimizam o manuseamento das amostras, tornando a cromatografia baseada em aminoácidos útil no desenvolvimento de metodologias em condições não desnaturantes, livres de RNases e solventes orgânicos, particularmente importantes em vários estudos estruturais e funcionais bem como de aplicabilidade terapêutica. Com os resultados positivos destas metodologias de afinidade na purificação de RNA foi também desenvolvido e validado (de acordo com a legislação internacional e europeia para métodos bioanalíticos) um método analítico para a quantificação e monotorização de RNA. Com a crescente importância, a nível terapêutico, do desenvolvimento de novas ferramentas analíticas para avaliar o RNA, uma vez que ainda existem várias lacunas nas técnicas actuais de quantificação de RNA, tais como a falta de selectividade, tornou-se imperativo avaliar a potencialidade dos suportes de afinidade neste campo. A versatilidade da metodologia foi demonstrada pela sua aplicabilidade na quantificação de RNA de diferentes fontes eucarióticas e também em amostras complexas de RNA quimicamente sintetizado, o que demonstrou a usa utilidade em múltiplas áreas de investigação. Desenvolveu-se ainda mais um estudo no isolamento e purificação de RNA com base nas matrizes de aminoácidos, em particular com matriz de arginina, de modo a aproximar a aplicabilidade desta técnica à prática terapêutica. Neste caso, o novo objectivo foi explorar o seu potencial na purificação de moléculas de RNA mensageiro (mRNA) não a partir de células, mas a partir de reacções sintéticas de transcrição in vitro, com o interesse de aplicar as moléculas em terapias de vacinação com mRNA no cancro do colo do útero. As moléculas de mRNA que codificavam para as proteínas E6 e E7 do vírus do papiloma humano (VPH) 16 foram purificadas com sucesso de uma série de impurezas próprias das reacções de transcrição in vitro, com são o pDNA molde, as enzimas, nucleótidos, sais e tampões, e a sua caracterização em termos de rendimento, pureza e integridade foi avaliada. Neste trabalho, a cromatografia de arginina voltou a demonstrar a sua capacidade singular em melhorar os processos de purificação, pelas vantagens de eliminar passos adicionais e melhorar a economia global do processo de produção. Em suma, esta tese permitiu o desenvolvimento de novas metodologias para a purificação e quantificação de RNA revelando várias características interessantes das moléculas, incluindo o seu comportamento cromatográfico e interacções naturais que podem ocorrer com os suportes de aminoácidos. Por conseguinte, estes métodos mostraram uma potencial aplicabilidade polivalente, contribuindo para o progresso das investigações fundamentais e terapêuticas baseadas no RNA, suportando a utilização da cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos no desenvolvimento futuro de novos processos de preparação de RNA.
A sequenciação completa do genoma humano ofereceu novos horizontes relativamente à prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças humanas. Para além disso, com o avanço da engenharia genética, têm surgido novas tecnologias terapêuticas, entre as quais se destacam a terapia génica utilizando ácidos nucleicos. Apesar destas estratégias génicas se terem iniciado com o DNA (ácido desoxirribonucleico), estudos recentes têm avaliado o potencial interesse terapêutico do RNA (ácido ribonucleico). O RNA foi recentemente reconhecido como uma molécula fundamental nos processos celulares, com implicações fundamentais na evolução dos organismos, na hereditariedade e na regulação de vários genes, o que destacou o seu vasto potencial terapêutico e conduziu ao aparecimento de várias terapias baseadas em moléculas de RNA. Os resultados promissores dessas novas abordagens terapêuticas têm vindo a reforçar a investigação relacionada com as moléculas de RNA, a avaliar pelo número, cada vez mais elevado, de estudos estruturais, biofísicos e biomédicos presentes na literatura. Além disso, a indústria biotecnológica e farmacêutica começam a visar as moléculas de RNA como uma nova classe de produtos bioterapêuticos. Um requisito fundamental em todos esses estudos é a obtenção de grandes quantidades de RNA isolado e puro e de integridade assegurada. Como por exemplo, em biologia molecular a purificação de RNA é o primeiro passo chave para avaliar a expressão de um gene, uma vez que a realização bem como a reprodutibilidade e relevância biológica dessa experiência está dependente da quantidade e qualidade das preparações de RNA. Por outro lado, as terapias promissoras e revolucionárias baseadas em RNA, como a vacinação ou utilização de biofármacos recombinantes envolvem formulações de RNA que devem satisfazer critérios de qualidade rigorosos recomendados por agências reguladoras internacionais. No entanto, o processo de purificação das moléculas de RNA pode ser um passo bastante limitante para o sucesso da sua aplicação terapêutica. O RNA tem uma série de características químicas únicas que se reflectem na sua conformação estrutural. Apesar do RNA ser uma molécula de cadeia simples na sua base, ele tem uma elevada propensão para formar estruturas secundárias e terciárias bastante complexas. São estas compactações próprias das moléculas de RNA que definem as suas importantes funções biológicas. A elevada reactividade química é outra característica própria do RNA e com grande relevância biológica a nível regulatório, por proporcionar mais instabilidade à molécula aumentando a sua susceptibilidade à degradação. Num contexto laboratorial, estas características moleculares do RNA são enormes desafios para a sua extracção e purificação, pois a sua actividade biológica e integridade podem ser facilmente comprometidas durante os procedimentos devido à presença ubíqua de enzimas que o degradam. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para superar os desafios inerentes ao isolamento e purificação de moléculas de RNA, tais como a extracção com fenol e clorofórmio ou as extracções em fase sólida empregando colunas ou esferas de sílica (SPE), bem como algumas técnicas de purificação com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa e troca iónica. No entanto, estas ainda apresentam várias limitações nomeadamente em relação ao elevado tempo despendido e à necessidade do uso de solventes tóxicos e condições desnaturantes durante os procedimentos. Por todos estes motivos, torna-se evidente o crescente interesse na avaliação e melhoria das metodologias actualmente utilizadas para o isolamento e purificação de RNA de modo a satisfazer os requisitos necessários à sua aplicação. A cromatografia é um dos métodos mais diversos e potentes em biotecnologia, tanto a nível analítico como preparativo devido à sua simplicidade, robustez, versatilidade e alta reprodutibilidade. Por sua vez, a cromatografia de afinidade é reconhecida como uma técnica poderosa apresentando grande aplicabilidade na purificação de muitas biomoléculas, incluindo o DNA plasmídico (pDNA) e proteínas, porque explora o reconhecimento biomolecular, ou seja, a capacidade de uma macromolécula biologicamente activa formar complexos específicos e reversíveis com ligandos de afinidade. Posto isto, o trabalho desenvolvido no âmbito desta tese incide na crescente necessidade de desenvolver novas estratégias de isolamento e purificação para moléculas de RNA de modo a ultrapassar as limitações ainda existentes nas metodologias actuais, contribuindo para a evolução e sucesso da investigação e aplicações terapêuticas do RNA. Para isso, a potencialidade da cromatografia de afinidade foi considerada nesta temática e foi explorada a aplicação de aminoácidos como ligandos de afinidade. Este trabalho foi baseado em vários estudos de reconhecimento molecular e atómico que descrevem a existência de diferentes interacções entre proteínas e ácidos nucleicos nos sistemas biológicos, especialmente com aminoácidos básicos como a histidina e a arginina, e também na hipótese de existirem interacções preferenciais entre os aminoácidos e as bases nucleotídicas. Além disso, estudos recentes de processos de purificação mostraram grande aplicabilidade destes aminoácidos em isolar e purificar moléculas de pDNA biologicamente activas para aplicação em terapia génica e vacinas. Assim sendo, novas metodologias preparativas e analíticas foram alcançadas ao longo deste trabalho, ou seja, foi possível obter preparações de RNA a partir de diferentes fontes biológicas e de reacções sintéticas com elevados rendimentos e grau de pureza e de integridade preservada, bem como também foi possível o desenvolvimento de um método analítico para a sua quantificação e monitorização. A potencial aplicabilidade da cromatografia de afinidade, usando histidina como ligando de afinidade, na purificação de moléculas de RNA foi demonstrada pela primeira vez com a purificação do RNA 6S, um RNA regulatório não codificante presente nos procariotas, nomeadamente em Escherichia coli (E. coli), que tem uma função reguladora importante no processo de transcrição deste organismo. Nas estratégias de purificação com histidina foram usados gradientes de sulfato de amónio devido à presença do anel de imidazol na cadeia lateral aromática do aminoácido, o que permitiria explorar interacções maioritariamente hidrofóbicas entre o RNA e a matriz, quer por interacção com o anel ou por pontes de hidrogénio. Assim, foi utilizado um gradiente decrescente em concentração de sulfato de amónio em três etapas que revelou um reconhecimento bioespecífico com RNA 6S, permitindo a sua purificação de uma mistura complexa de outras moléculas de RNA de baixo peso molecular (sRNA). Uma segunda nova estratégia desenvolvida com a matriz de histidina permitiu obter simultaneamente o isolamento e purificação das classes de sRNA e RNA ribossómico (rRNA) a partir de lisados celulares de E. coli. Neste estudo, ambas as classes foram separadas das impurezas do hospedeiro (DNA genómico e proteínas) com elevado rendimento e grau de pureza quando comparadas com amostras preparadas com métodos de isolamento convencionais baseados na extracção com fenol e clorofórmio. No entanto, a metodologia baseada na cromatografia com histidina demonstrou a vantagem de evitar o uso de produtos químicos tóxicos durante o processo. A versatilidade da matriz de histidina na purificação de RNA, tanto de moléculas específicas (RNA 6S) como das classes (sRNA e rRNA) sugeriu que o mecanismo de interacção envolveria não só interacções hidrofóbicas, mas também um bioreconhecimento das bases do RNA pela histidina. Apesar das preparações de RNA obtidas com estes métodos necessitarem de caracterização funcional adicional para provar a sua aplicabilidade, o uso da cromatografia de afinidade com histidina representa um grande avanço no isolamento de moléculas de RNA, uma vez que as técnicas tradicionais não têm a capacidade de fraccionar RNA ao nível de um tipo de molécula ou de isolar sRNA e rRNA num só processo. Todavia, a necessidade de aplicar elevadas concentrações de sal nestas metodologias pode ser visto como uma desvantagem, principalmente no que diz respeito à aplicação biotecnológica, pois acarreta maiores custos de processo e tem maior impacto ambiental. O uso de arginina como aminoácido imobilizado na cromatografia de afinidade foi utilizado na perspectiva de melhorar as técnicas anteriores uma vez que este aminoácido se apresenta sobretudo carregado positivamente, pelo que poderiam ser exploradas interacções electrostáticas para a purificação de RNA utilizando condições de eluição moderadas. Além disso, as interacções de arginina têm sido reconhecidas como as mais prevalentes nos complexos RNA-proteína, aumentando a potencialidade de purificação por um maior bioreconhecimento entre as moléculas de RNA e a matriz de arginina. Deste modo, um gradiente com o aumento gradual da concentração de cloreto de sódio permitiu o isolamento e purificação do RNA total de extractos celulares eucarióticas. O suporte de arginina demonstrou uma aplicabilidade excepcional para interagir com todas as classes funcionais do RNA apesar da sua diversidade estrutural e as suas diferentes conformações em condições nativas. Essas interacções mais fortes e selectivas parecem advir da cadeia lateral do aminoácido de arginina que apresenta uma multiplicidade para interacções, podendo promover um contacto múltiplo com o RNA, através da sua estrutura açúcar-fosfato ou com as suas bases, atendendo ao seu estado conformacional. Embora as interacções electrostáticas entre os grupos fosfato do RNA e os ligandos de arginina possam desempenhar uma função importante na retenção do RNA na coluna, as interacções com as bases também estão envolvidas e modulam de alguma forma a interacção favorecida e a especificidade encontradas na cromatografia com arginina. Assim, neste processo de purificação verificou-se um elevado rendimento de recuperação do RNA total e pelas análises de controlo de qualidade efectuadas mostrou-se que este apresentava uma elevada integridade bem como uma boa pureza, demonstrada pela difícil detecção de proteínas nas amostras purificadas e pela redução de DNA genómico para concentrações residuais. A eficiência desta técnica de purificação e a aplicabilidade do RNA por ela obtido foi demonstrada num procedimento habitualmente usado em biologia molecular para a análise de expressão génica. As amostras de RNA total foram usadas com sucesso como moldes na reacção em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a avaliação da expressão de dois genes controlo geralmente empregues nestes procedimentos. Reunindo os resultados anteriormente descritos, o isolamento e purificação de RNA de amostras biológicas complexas usando as técnicas de cromatografia de afinidade com aminoácidos imobilizados demostrou vários benefícios em relação a métodos de isolamento actualmente empregues, como a extracção de fenol e clorofórmio ou de SPE, uma vez que simplificam a integração do processo e minimizam o manuseamento das amostras, tornando a cromatografia baseada em aminoácidos útil no desenvolvimento de metodologias em condições não desnaturantes, livres de RNases e solventes orgânicos, particularmente importantes em vários estudos estruturais e funcionais bem como de aplicabilidade terapêutica. Com os resultados positivos destas metodologias de afinidade na purificação de RNA foi também desenvolvido e validado (de acordo com a legislação internacional e europeia para métodos bioanalíticos) um método analítico para a quantificação e monotorização de RNA. Com a crescente importância, a nível terapêutico, do desenvolvimento de novas ferramentas analíticas para avaliar o RNA, uma vez que ainda existem várias lacunas nas técnicas actuais de quantificação de RNA, tais como a falta de selectividade, tornou-se imperativo avaliar a potencialidade dos suportes de afinidade neste campo. A versatilidade da metodologia foi demonstrada pela sua aplicabilidade na quantificação de RNA de diferentes fontes eucarióticas e também em amostras complexas de RNA quimicamente sintetizado, o que demonstrou a usa utilidade em múltiplas áreas de investigação. Desenvolveu-se ainda mais um estudo no isolamento e purificação de RNA com base nas matrizes de aminoácidos, em particular com matriz de arginina, de modo a aproximar a aplicabilidade desta técnica à prática terapêutica. Neste caso, o novo objectivo foi explorar o seu potencial na purificação de moléculas de RNA mensageiro (mRNA) não a partir de células, mas a partir de reacções sintéticas de transcrição in vitro, com o interesse de aplicar as moléculas em terapias de vacinação com mRNA no cancro do colo do útero. As moléculas de mRNA que codificavam para as proteínas E6 e E7 do vírus do papiloma humano (VPH) 16 foram purificadas com sucesso de uma série de impurezas próprias das reacções de transcrição in vitro, com são o pDNA molde, as enzimas, nucleótidos, sais e tampões, e a sua caracterização em termos de rendimento, pureza e integridade foi avaliada. Neste trabalho, a cromatografia de arginina voltou a demonstrar a sua capacidade singular em melhorar os processos de purificação, pelas vantagens de eliminar passos adicionais e melhorar a economia global do processo de produção. Em suma, esta tese permitiu o desenvolvimento de novas metodologias para a purificação e quantificação de RNA revelando várias características interessantes das moléculas, incluindo o seu comportamento cromatográfico e interacções naturais que podem ocorrer com os suportes de aminoácidos. Por conseguinte, estes métodos mostraram uma potencial aplicabilidade polivalente, contribuindo para o progresso das investigações fundamentais e terapêuticas baseadas no RNA, suportando a utilização da cromatografia de afinidade baseada em aminoácidos no desenvolvimento futuro de novos processos de preparação de RNA.
Descrição
Palavras-chave
Ácido ribonucleico (RNA) - Purificação Cromatografia de afinidade Cromatografia de afinidade - Aminoácidos Arginina Listidina