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Screening of Bioaffinity ligands for human soluble COMT purification
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Passarinha, Luís António Paulino | |
| dc.contributor.advisor | Queiroz, João António de Sampaio Rodrigues | |
| dc.contributor.author | Costa, Sara Rute Afonso | |
| dc.date.accessioned | 2015-11-24T15:22:09Z | |
| dc.date.available | 2015-11-24T15:22:09Z | |
| dc.date.issued | 2010 | |
| dc.description.abstract | Catechol-O-methyltransferase (COMT), play an important role in the metabolism of catecholamines, catecholestrogens and catechol drugs and consequently has a closer relationship with several mental disorders. As a result, while the development of pharmaceutical Human Soluble COMT (hSCOMT) trials for a rational drug design depends on the availability of high purified samples, more suitable purification strategies must be developed and emerged in order to fulfil the requirements of pharmaceutical industry. In this context, the global aim of this work was the improvement of recovery yields and activity protein results in a hSCOMT purification process. Therefore, the work was being oriented according to three intermediate goals. Two first’s concerning Hidrophobic Interaction Chromatography; (1) Octyl-sepharose support in order to analyse new fractionation methods by testing destabilizing elution conditions with the incorporation of L-arginine in the mobile phase; (2) the application of a dual salt system in Epoxy-sepharose resin; (3) the pseudo-bioaffinity chromatography using six commercial resins with immobilized amino acids, examining the ligands performance, in order to understand the selectivity’s achieved based on non-specific desorption profiles supported on pH and ionic strength manipulation. In general for Epoxy-sepharose support, the concentrations of dual salt system required to allow hSCOMT retention was above 0,7 M NH2SO4/0,15 M Na3C6H5O7. Indeed, this strategy is needless, considering previous purification strategies described that allow satisfatory protein selectivity and purification factor with less salt concentration; and consequently with a reduction in hSCOMT denaturation effects. The L-arginine is highly effective in improving the performance of various chromatographic columns. However, is this study preliminary stability assays showed that this amino acid decreases hSCOMT specific activity; showing that this strategy do not comprise hSCOMT purification strategy requests. This is the first report using amino acids as immobilized ligands (AAIL’s) as pseudo-bioaffinity supports in hSCOMT isolation. Based on non-specific desorption profiles the results show that; (1) the high concentrations necessary to promote hSCOMT retention, decreasing product activity recovery; (2) for pH approach, the requirement of acidic pH’s to allow hSCOMT retention leads to a molecular weight alteration and consequently loss of enzymatic activity. The comparison between these two strategies, reveal that the hSCOMT molecular weight discrepancy are not AAIL dependent, but due to binding conditions. In conclusion, the comparison of these three approaches in this dissertation demonstrated the complexity of hSCOMT purification processes. In spite of, structural studies are need to understand the hSCOMT-AAIL binding mechanism, these supports have furthermost advantages over the earlier methods published due of its simplicity and efficiency for hSCOMT purification. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Nos finais de 1950, Alxelrod e co-autores descreveram a enzima responsável pela O-metilação de catecolaminas e outros catecóis, e no mesmo ano a Catecol-Ometiltransferase (COMT) foi parcialmente purificada e caracterizada. Desde então, foram efectuados vários estudos para caracterizar os três polimorfismos mais frequentes da forma humana da COMT, responsáveis por lhe conferir susceptibilidade térmica e oxidativa. Estes polimorfismos podem ter implicações clínicas, e são o factor genético preponderante em várias doenças neurodegenerativas que envolvam os sistemas catecolaminergicos. Nos últimos 40 anos, foram descritas várias estratégias de purificação, utilizando vários extractos biológicos, e consequentemente vários métodos bioquímicos de separação. Apesar de todos os desenvolvimentos tornam-se necessários métodos de purificação mais simples, rápidos e eficazes que confiram um grau de pureza mais elevado sem comprometer a actividade enzimática da Catecol-Ometiltransferase humana na forma solúvel (hSCOMT). O objectivo global deste trabalho foi desenvolver/melhorar os processos de purificação da hSCOMT, aumentando o grau de purificação e de recuperação da actividade enzimática para aplicação em domínios farmacológicos, cinéticos e estruturais. Deste modo o trabalho desenvolvido foi assente em três objectivos; os dois primeiros utilizando Cromatografia de Interacção Hidrofóbica (HIC), sendo que no suporte Octil-sepharose o objectivo foi analisar o efeito de agentes destabilizadores, a L-arginina; e no suporte Epoxi-sefarose foi analisar o efeito do sistema de dois sais nomeadamente, citrato de sódio (Na3C6H5O7) e sulfato de amónio (NH2SO4). Por último, utilizar cromatografia de pseudo-bioafinidade em suportes com aminoácidos imobilizados, com o objectivo de analisar a selectividade destes suportes utilizando estratégias de eluição não específicas, sal e alteração de pH. Estudos realizados pelo nosso grupo de investigação, demonstraram que a estratégia do sistema de dois sais apresenta uma selectividade adequada e consequentemente um factor de purificação incrementado, reduzindo-se assim os efeitos de desnaturação da proteína hSCOMT na presença de elevadas concentrações de sal. Deste modo, tornou-se conveniente analisar a aplicação de uma estratégia de dois sais no suporte Epoxi-sefarose com o objectivo de melhorar o processo de purificação da enzima hSCOMT. Especialmente os resultados demonstraram que, neste suporte, as concentrações de sal necessárias para promover a retenção da hSCOMT são superiores a 0,7 M NH2SO4/0,15 M Na3C6H5O7, tornando assim esta estratégia inadequada em comparação com estratégias já descritas. Em geral, devido à forte ligação hidrofóbica entre proteínas e suportes cromatográficos, a eluição poderá ser comprometida, não permitindo eluições com a simples diminuição da concentração de sal. Este facto é relevante na interacção entre hSCOMT-Octil, em que a utilização dos sistemas de dois sais necessita da diminuição da temperatura de modo a promover a eluição completa da proteína alvo. Em geral, os amino ácidos, têm sido amplamente utilizados, para melhorar estratégias de purificação ou para estabilizar proteínas durante o processo cromatográfico. Especificamente, a L-arginina é altamente eficiente melhorando o desempenho de colunas cromatográficas. Neste caso, torna-se conveniente a optimização dos métodos de fraccionamento no suporte Octyl, testando condições de eluição destabilizadoras pela incorporação da L-arginina na fase móvel. No trabalho desenvolvido, estudos preliminares mostram que este aminoácido poderá interferir na estrutura nativa da COMT, promovendo uma diminuição da actividade específica. Adicionalmente, o grau de purificação alcançado denota que a estratégia apresentada não cumpre os requisitos necessários para a purificação da proteína alvo. Os suportes de aminoácidos têm sido utilizados na separação de várias biomoléculas, no entanto, estes suportes nunca foram utilizados na purificação da proteína hSCOMT. Deste modo, o último objectivo é analisar a performance de ligandos típicos de pseudo-bioafinidade (L-arginina, L-metionina, L-histidina, Laspartato, L- glutamina and L-leucina) como etapa central no isolamento da COMT, de modo a compreender a selectividade alcançada. Especialmente, foram utilizados perfis de eluição não específicos baseados na manipulação do pH e na concentração de sal. As condições utilizadas de forma a promover a retenção da hSCOMT mostraram que: 1) são necessárias altas concentrações para promover a retenção da proteína, que favorecem o decréscimo da actividade da proteína; 2) na manipulação de pH, a necessidade de pH’s ácidos para promover a retenção da hSCOMT, levam a uma alteração do peso molecular e consequente perda de actividade enzimática. Em síntese conclui-se, comparando as duas estratégias utilizadas, que o factor crítico para este facto é independente dos suportes utilizados, e altamente influenciável pelas condições estabelecidas para promover a ligação da hSCOMT. Como conclusão, a comparação entre as três abordagens descritas na dissertação demonstram as limitações existentes no delineamento das estratégias de purificação desta proteína a partir de misturas biológicas complexas. No entanto, comparando entre as três partes exploradas, e apesar de serem necessários estudos estruturais de modo a caracterizar e compreender o mecanismo de ligação, os suportes de aminoácidos tornam-se mais vantajosos devido a simplicidade e eficiência nos processos cromatográficos. | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/3923 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Catecol-O-Metiltransferase (COMT) | pt_PT |
| dc.subject | Cromatografia de interacção hidrofobica (HIC) | pt_PT |
| dc.subject | Cromatografia de pseudo-bioafinidade | pt_PT |
| dc.subject | Purificação | pt_PT |
| dc.title | Screening of Bioaffinity ligands for human soluble COMT purification | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Mestrado em Bioquímica | pt_PT |