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Publication
Chronotherapy of Brain Diseases: Assessment of the Circadian Rhythms of Efflux Transporters at the Blood-cerebrospinal Fluid Barrier
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Authors
Abstract(s)
The choroid plexus (CP) is an integral part of the blood cerebrospinal-fluid barrier (BCSFB). The CP is formed by a monolayer of cuboidal epithelial cells united by tight junctions. On the apical side, these cells present microvilli and are in contact with the cerebrospinal fluid (CSF). On the basal membrane, these cells are surrounded by a vast network of capillary blood vessels. The CP is responsible for several functions that are vital to the homeostasis of the central nervous system (CNS) where we include the production of the CSF, synthesis of several proteins, CNS protection against foreign elements, CSF detoxification from noxious compounds that result from normal cell metabolism and the transport of multiple molecules across the BCSFB. The CP has an essential role on the transport across the BCSFB of therapeutic molecules targeting the CNS. For that, it expresses multiple membrane transporters that have been described in the literature as essential for the transport of therapeutic compounds across CNS biological barriers. Recently, a functional molecular clock was described in the CP. This means that the biological functions of this structure might have a circadian rhythmicity associated. There's the possibility that this circadian clock influences membrane transporters' expression and activity at the CP which would result in circadian changes of the bioavailability of therapeutic compounds in the CNS depending on the time of administration. As such, the main goal of this doctoral thesis was to analyse the influence of circadian rhythms on the expression of multiple membrane transporters on the CP. Additionally, we used therapeutic compounds, namely methotrexate (MTX) and donepezil (DNPZ) to assess the relation between the CP's membrane transporters circadian expression and their drug transport function across the BCSFB. One of the objectives of this project, as mentioned earlier, was to assess the circadian expression of multiple CP’s membrane transporters. For that, CP primary cell cultures of neonate rats were used. We concluded that rSlc9a1 and rSlc1a5 expression was rhythmic during a 24-hour period while rSlc47a1 did not reveal a circadian pattern. This work also aimed at disclosing the influence of sex on the daily expression oscillations of several ABC and SLC membrane transporters expressed by the CP. For this we used CPs from male, female, ovariectomized and sham-operated female rats. The results showed that the membrane transporter rAbcc1 is expressed in a circadian manner in the CP of male rats, while rAbcg2 presented circadian rhythmic expression in the CP of female rats. Both rAbcc4 and rOat3 were rhythmically expressed in the CP of male and female rats. Next, we used an in vitro model of the CP in order to evaluate the relevance of Abcc4’s circadian expression in the transport of MTX across the BCSFB. We demonstrated that MTX transport across the BCSFB was rhythmic. Besides, we also concluded that Abcc4 circadian expression might influence the MTX circadian transport across the BCSFB. Finally, this project also aimed to describe the impact of circadian rhythms on CP Abcg2 expression and also on the circadian transport profile of DNPZ across the BCSFB. Using CP primary cell cultures of neonate rats, we demonstrated the presence of rAbcg2 circadian expression. Next, using primary cell cultures, an in vitro model of the BCSFB was established and we discovered that DNPZ transport across the BCSFB presents circadian rhythmicity. Furthermore, it was also proposed that besides rABCG2, SLC22A4 could also be involved in the DNPZ circadian transport across the BCSFB. The results obtained in this project demonstrate that membrane transporters present circadian expression in the BCSFB. Moreover, the transport of therapeutic compounds, such as MTX and DNPZ, across the BCSFB is also influenced by the circadian rhythm of CP membrane transporters. In the future, it is essential to further exploit the role of circadian rhythms on the expression of membrane transporters at the CP and its influence on the transport of therapeutic compounds across the BCSFB. This information might prove vital in the treatment of CNS diseases. By timing drug administration with the period when they are more prone to reach the target tissue at the CNS, we are ensuring their maximum target tissue concentration, and a reduction in side effects.
A barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BSLCR) é formada por uma estrutura denominada de Plexo Coróide (PC). O PC é constituído por uma monocamada de células epiteliais unidas por junções apertadas. Na membrana apical, estas células apresentam microvilosidades e estão em contacto com o líquido cefalorraquidiano (LCR). Na membrana basal, as células estão rodeadas por capilares sanguíneos. O PC é responsável por diversas funções indispensáveis ao funcionamento do sistema nervoso central (SNC) onde se inclui a produção de LCR, a síntese de diversas proteínas, proteção do SNC contra elementos estranhos, destoxificação do LCR de compostos nocivos resultantes do metabolismo normal do SNC e transporte de diversas moléculas através da BSLCR. O PC apresenta um papel essencial no transporte de moléculas terapêuticas destinadas ao SNC através da BSLCR. Para isso, expressa proteínas transportadoras de membrana que estão descritas como essenciais no transporte de fármacos através das barreiras do cérebro. Recentemente, foi descrito no PC um relógio molecular funcional. Como tal, as funções biológicas desta estrutura poderão estar associadas ao ritmo circadiano. Existe a possibilidade deste relógio circadiano influenciar a expressão e atividade de diversos transportadores de membrana no PC, resultando numa modificação da biodisponibilidade de moléculas terapêuticas no SNC ao longo do dia, dependendo da hora a que são administradas. Como tal, o trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento teve como principal objetivo a análise da influência do ritmo circadiano na expressão de diversos transportadores de membrana localizados no PC. Para além disso, procedeu-se à utilização de compostos terapêuticos, nomeadamente metotrexato (MTX) e donepezil (DNPZ), para avaliar a relação entre a expressão circadiana dos transportadores de membrana e a sua função no transporte de fármacos através da BSLCR. Em particular, um dos objetivos deste projeto foi avaliar a expressão circadiana de múltiplos transportadores de membrana presentes no PC. Sendo assim, utilizando culturas primárias de PC de ratos neonatais, constatou-se que a expressão dos transportadores de membrana rSlc9a1 e rSlco1a5 apresentava uma ritmicidade circadiana ao contrário da expressão do transportador de membrana rSlc47a1 que se manteve constante ao longo de 24 horas. Com o objetivo de explorar o impacto das diferenças entre sexos nas oscilações diárias dos transportadores de membrana da família ABC e SLC presentes no PC de rato, foram utilizados PC recolhidos de ratos macho, fêmeas, fêmeas ovariectomizadas e fêmeas controlo. Os resultados obtidos demonstram que o transportador de membrana rAbcc1 é expresso de forma rítmica no PC de ratos macho, e o rAbcg2 em ratos fêmea. Os transportadores rAbcc4 e rOat3 são ambos expressos ritmicamente em machos e fêmeas. Posteriormente, para avaliar a relevância da expressão circadiana do Abcc4 no transporte de MTX através da BSLCR foi utilizado um modelo in vitro da barreira. Verificou-se que o transporte de MTX através da BSLCR apresenta ritmicidade. A expressão rítmica do rAbcc4 poderá ser uma das razões para o transporte do MTX, através da BSLCR, ser dependente do ritmo circadiano. Outro dos objetivos deste projeto era caraterizar a regulação circadiana da expressão do Abcg2 e posteriormente estudar o perfil circadiano de transporte do DNPZ através da BSLCR. Utilizando culturas primárias de PC de ratos neonatais, observou-se uma expressão rítmica do transportador de membrana rAbcg2. Com recurso a um modelo in vitro da barreira que tinha por base as culturas primárias de PC de ratos neonatais, observou-se que o transporte de DNPZ através da BSLCR apresentava uma ritmicidade circadiana. É ainda proposto que para além do envolvimento do ABCG2, também o SLC22A4 poderá ter influência no transporte rítmico de DNPZ através da BSLCR. Os resultados obtidos neste projeto permitem afirmar que os transportadores de membrana apresentam uma expressão rítmica na BSLCR. Foi possível observar a influencia da expressão rítmica destes transportadores de membrana no transporte de moléculas terapêuticas como o MTX e DNPZ. No futuro será importante continuar a explorar o papel do ritmo circadiano na expressão de transportadores de membrana no PC e a sua influência no transporte de fármacos através da BSLCR. Esta informação poderá revelar-se crucial no tratamento de doenças do SNC. Ao adequar o período de administração do fármaco ao ritmo biológico do paciente, estaremos a garantir o máximo de concentração de fármaco no local desejado, e uma redução dos efeitos secundários.
A barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BSLCR) é formada por uma estrutura denominada de Plexo Coróide (PC). O PC é constituído por uma monocamada de células epiteliais unidas por junções apertadas. Na membrana apical, estas células apresentam microvilosidades e estão em contacto com o líquido cefalorraquidiano (LCR). Na membrana basal, as células estão rodeadas por capilares sanguíneos. O PC é responsável por diversas funções indispensáveis ao funcionamento do sistema nervoso central (SNC) onde se inclui a produção de LCR, a síntese de diversas proteínas, proteção do SNC contra elementos estranhos, destoxificação do LCR de compostos nocivos resultantes do metabolismo normal do SNC e transporte de diversas moléculas através da BSLCR. O PC apresenta um papel essencial no transporte de moléculas terapêuticas destinadas ao SNC através da BSLCR. Para isso, expressa proteínas transportadoras de membrana que estão descritas como essenciais no transporte de fármacos através das barreiras do cérebro. Recentemente, foi descrito no PC um relógio molecular funcional. Como tal, as funções biológicas desta estrutura poderão estar associadas ao ritmo circadiano. Existe a possibilidade deste relógio circadiano influenciar a expressão e atividade de diversos transportadores de membrana no PC, resultando numa modificação da biodisponibilidade de moléculas terapêuticas no SNC ao longo do dia, dependendo da hora a que são administradas. Como tal, o trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento teve como principal objetivo a análise da influência do ritmo circadiano na expressão de diversos transportadores de membrana localizados no PC. Para além disso, procedeu-se à utilização de compostos terapêuticos, nomeadamente metotrexato (MTX) e donepezil (DNPZ), para avaliar a relação entre a expressão circadiana dos transportadores de membrana e a sua função no transporte de fármacos através da BSLCR. Em particular, um dos objetivos deste projeto foi avaliar a expressão circadiana de múltiplos transportadores de membrana presentes no PC. Sendo assim, utilizando culturas primárias de PC de ratos neonatais, constatou-se que a expressão dos transportadores de membrana rSlc9a1 e rSlco1a5 apresentava uma ritmicidade circadiana ao contrário da expressão do transportador de membrana rSlc47a1 que se manteve constante ao longo de 24 horas. Com o objetivo de explorar o impacto das diferenças entre sexos nas oscilações diárias dos transportadores de membrana da família ABC e SLC presentes no PC de rato, foram utilizados PC recolhidos de ratos macho, fêmeas, fêmeas ovariectomizadas e fêmeas controlo. Os resultados obtidos demonstram que o transportador de membrana rAbcc1 é expresso de forma rítmica no PC de ratos macho, e o rAbcg2 em ratos fêmea. Os transportadores rAbcc4 e rOat3 são ambos expressos ritmicamente em machos e fêmeas. Posteriormente, para avaliar a relevância da expressão circadiana do Abcc4 no transporte de MTX através da BSLCR foi utilizado um modelo in vitro da barreira. Verificou-se que o transporte de MTX através da BSLCR apresenta ritmicidade. A expressão rítmica do rAbcc4 poderá ser uma das razões para o transporte do MTX, através da BSLCR, ser dependente do ritmo circadiano. Outro dos objetivos deste projeto era caraterizar a regulação circadiana da expressão do Abcg2 e posteriormente estudar o perfil circadiano de transporte do DNPZ através da BSLCR. Utilizando culturas primárias de PC de ratos neonatais, observou-se uma expressão rítmica do transportador de membrana rAbcg2. Com recurso a um modelo in vitro da barreira que tinha por base as culturas primárias de PC de ratos neonatais, observou-se que o transporte de DNPZ através da BSLCR apresentava uma ritmicidade circadiana. É ainda proposto que para além do envolvimento do ABCG2, também o SLC22A4 poderá ter influência no transporte rítmico de DNPZ através da BSLCR. Os resultados obtidos neste projeto permitem afirmar que os transportadores de membrana apresentam uma expressão rítmica na BSLCR. Foi possível observar a influencia da expressão rítmica destes transportadores de membrana no transporte de moléculas terapêuticas como o MTX e DNPZ. No futuro será importante continuar a explorar o papel do ritmo circadiano na expressão de transportadores de membrana no PC e a sua influência no transporte de fármacos através da BSLCR. Esta informação poderá revelar-se crucial no tratamento de doenças do SNC. Ao adequar o período de administração do fármaco ao ritmo biológico do paciente, estaremos a garantir o máximo de concentração de fármaco no local desejado, e uma redução dos efeitos secundários.
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Keywords
Plexo coróide Transportadores de membrana Barreira sangue-líquido cefalorraquidiano Cronoterapia Metotrexato Donepezil Choroid plexus Membrane transporters Blood cerebrospinal-fluid barrier Chronotherapy Methotrexate