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Authors
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Abstract(s)
Parkinson’s disease (PD) is the second common neurodegenerative disorder, characterized by massive dopaminergic (DAergic) neuronal death in the substantia nigra and resulting in a reduced level of dopamine (DA) in the striatum. Although both genetic and environmental factors are thought to affect the onset of PD, the precise mechanisms at the molecular level have not been fully elucidated. However, mitochondrial dysfunction and oxidative stress are suggested as major causes of neurodegeneration in PD.
Astrocytes are the most abundant glial cell type in the brain. These cells are known to harbor powerful neuroprotective machinery allowing them to secrete neurotrophic factors and activate anti-oxidative stress pathways, thereby supporting neurons and ensuring their survival. Therefore, astrocyte dysfunction may compromise neuronal survival and, in this way, facilitate neurodegeneration. This dysfunction was already demonstrated in human samples and in experimental models of PD.
Mutations in DJ-1 gene (PARK7) leading to a loss of functional protein cause familial PD and enhances the sensitivity to oxidative insults, so by elucidating DJ-1 physiological function important insights into PD will be achieved. DJ-1 is a ubiquitous redox-responsive cytoprotective protein with diverse functions but, of all the functions that have been attributed, perhaps the most important to PD is its neuroprotective role, most likely by its involvement in protection against oxidative stress. In recent studies, an increase in DJ-1’s expression was found in reactive astrocytes of PD brains and extensive research demonstrated that DJ-1 has the ability to protect neurons against oxidative and toxic insults. However, the function of astrocytic DJ-1 is still unknown.
Taking these facts together, the aim of this study was to determine how neuron-astrocyte interaction influences the expression of DJ-1 when oxidative stress is present and how this expression contributes to neuroprotection.
The present study allowed us to conclude that DJ-1 is expressed in primary midbrain cell cultures, and this expression is not altered when an oxidative stress insult is present. We also showed that the survival of DAergic neurons was affected when they were exposed to oxidative stress, even when astrocyes were present. Moreover, that lack of DJ-1 in culture media combined with oxidative insult impairs the astrocyte-mediated neuroprotection leading to a drastic reduction of neuronal survival. Furthermore, incubation of neurons with a fluorofore-coupled DJ-1 applied exogenously allowed us to demonstrate that in fact neurons have the ability to endocytose extracellular DJ-1. These results suggest that DJ-1 may be released into the culture medium probably by astrocytes when challenged with an oxidative stress insult and consequently be taken up by neurons, exerting a direct or indirect neuroprotective role.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum, caracterizada por uma progressiva disfunção motora decorrente da perda seletiva de neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta (SNpc), resultando numa diminuição dos níveis de dopamina no estriado. Apesar de se encontrar estabelecido que fatores genéticos e ambientais contribuem para o desenvolvimento da doença, os mecanismos precisos a nível molecular ainda não se encontram totalmente esclarecidos. Contudo, a disfunção mitocondrial e o stress oxidativo têm sido apontados como os principais responsáveis pela neurodegeneração, sendo que neste estudo o nosso foco recaiu especificamente sobre o stress oxidativo. Os radicais livres são moléculas altamente reativas caraterizadas por possuírem eletrões desemparelhados, altamente reativos que quando produzidas em pequenas quantidades nas células, como é o caso das espécies reativas de oxigénio, desempenham funções essenciais ao organismo. Contudo, estas espécies moleculares devem ser balanceadas com a produção de antioxidantes de forma a manter a homeostase celular. Assim, o aumento da concentração de radicais livres relativamente à concentração de antioxidantes conduz ao desencadear de uma condição de stress oxidativo. Os astrócitos são as células gliais com maior abundância no cérebro funcionando como células de suporte ou metabólicas. Estas células são conhecidas por possuírem uma poderosa maquinaria neuroprotetora que lhes confere a capacidade de secretar fatores neurotróficos bem como de ativar a maquinaria necessária às funções antioxidantes, contribuindo para o suporte e sobrevivência neuronal. Dadas estas características, estudos têm sugerido que os astrócitos possuem um papel importante no controlo de doenças neurodegenerativas incluindo a DP e a sua disfunção tem sido demonstrada em amostras de cérebro humano ou em modelos experimentais da DP. Mutações no gene (PARK7) que codifica para a DJ-1 resultam na perda funcional da proteína causando a forma familiar ou esporádica da DP, assim, a elucidação da função fisiológica da proteína contribuirá para importantes avanços no conhecimento da DP. A DJ-1 é uma proteína multifuncional que se encontra expressa tanto em neurónios como em astrócitos, sendo que, de todas as funções que lhe são atribuídas, a mais relevante para a DP é o seu papel neuroprotetor, provavelmente devido ao seu envolvimento na proteção contra o stress oxidativo funcionando como um sensor, uma vez que, a sua atividade é regulada pelo seu estado oxidativo e por esse motivo, a sobre-oxidação corresponde à forma inativa da proteína. Estudos postmortem realizados em cérebros de doentes com DP esporádica demonstraram que a DJ-1 é abundantemente expressa em astrócitos reativos. Dadas as propriedades neuroprotetoras anti-oxidantes e anti-apoptóticas da DJ-1, este aumento de expressão pode representar um mecanismo protetor compensatório, visto inúmeros estudos demonstrarem que a DJ-1 tem a capacidade de proteger os neurónios contra insultos tóxicos ou oxidativos. A vulnerabilidade neuronal presente nos processos neurodegenerativos associados à DP pode não resultar apenas da disfunção dos mecanismos neuronais mas, por outro lado, resultar da alteração das funções astrocitárias ou mesmo da interação neurónio-astrócito. Tendo em conta estes fatos, o objetivo deste estudo foi determinar como a interação neurónio-astrócito influencia a expressão da DJ-1 quando o stress oxidativo está presente e de que forma essa expressão contribui para a neuroprotecção. Assim, de forma a atingir o objetivo proposto, determinámos a expressão da DJ-1 em culturas primárias de astrócitos ou de neurónios do mesencéfalo ventral e em coculturas neurónio-astrócito expostas a concentrações crescentes de H2O2. Da observação dos resultados, concluímos que, tal como anteriormente descrito, a DJ-1 é expressa em todos os tipos de culturas embora não se tenham verificado aumentos significativos nos níveis intracelulares da proteína com o aumento da concentração de H2O2 utilizada. Além disso, também o contacto entre neurónios e astrócitos apenas através do meio de cultura pareceu não afetar os níveis intracelulares da DJ-1 quando condições controlo foram comparadas com condições oxidativas. Contudo esta abordagem não nos permitiu confirmar qual o perfil de secreção da DJ-1 para o meio de cultura perante um insulto oxidativo, como previamente descrito, ou a influência dessa secreção na proteção neuronal. Dada a necessidade de clarificar a influência da secreção da DJ-1 na sobrevivência neuronal, realizámos as culturas anteriormente descritas, mas adicionámos em simultâneo com o estímulo de H2O2 um anti-corpo anti-DJ-1, para promover a imunodepleção da DJ-1. Os resultados mostraram que o stress oxidativo provocado pela exposição a H2O2 levou ao aumento da morte dopaminérgica sendo a extensão da morte provocada por este estímulo significativamente maior quando se promoveu o bloqueio da DJ-1 presente no meio, o que sugere que a DJ-1 contribui significativamente para a proteção mediada pelos astrócitos. Uma vez provada a importância da DJ-1 secretada para o meio de cultura na neuroproteção mediada pelos astrócitos, o próximo passo foi verificar se os neurónios teriam a capacidade de endocitar a DJ-1 aplicada exogenamente, e marcada com um fluoróforo de modo a que pudesse ser seguida a sua posição. A análise de fluorescência em conjunto com a marcação por imunocitoquímica para a DJ-1 permitiu concluir que, de facto, os neurónios têm a capacidade de endocitar a DJ-1 exógena, podendo ser através deste mecanismo que a proteína exerce as suas funções intracelulares. A análise destes resultados permitiu-nos sugerir que possivelmente a DJ-1 possa ser secretada pelos astrócitos para o meio de cultura quando estes são estimulados por um insulto oxidativo, neste caso H2O2, sendo consequentemente endocitada pelos neurónios, onde exercem a sua ação, direta ou indireta na proteção neuronal mediada pelos astrócitos.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum, caracterizada por uma progressiva disfunção motora decorrente da perda seletiva de neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta (SNpc), resultando numa diminuição dos níveis de dopamina no estriado. Apesar de se encontrar estabelecido que fatores genéticos e ambientais contribuem para o desenvolvimento da doença, os mecanismos precisos a nível molecular ainda não se encontram totalmente esclarecidos. Contudo, a disfunção mitocondrial e o stress oxidativo têm sido apontados como os principais responsáveis pela neurodegeneração, sendo que neste estudo o nosso foco recaiu especificamente sobre o stress oxidativo. Os radicais livres são moléculas altamente reativas caraterizadas por possuírem eletrões desemparelhados, altamente reativos que quando produzidas em pequenas quantidades nas células, como é o caso das espécies reativas de oxigénio, desempenham funções essenciais ao organismo. Contudo, estas espécies moleculares devem ser balanceadas com a produção de antioxidantes de forma a manter a homeostase celular. Assim, o aumento da concentração de radicais livres relativamente à concentração de antioxidantes conduz ao desencadear de uma condição de stress oxidativo. Os astrócitos são as células gliais com maior abundância no cérebro funcionando como células de suporte ou metabólicas. Estas células são conhecidas por possuírem uma poderosa maquinaria neuroprotetora que lhes confere a capacidade de secretar fatores neurotróficos bem como de ativar a maquinaria necessária às funções antioxidantes, contribuindo para o suporte e sobrevivência neuronal. Dadas estas características, estudos têm sugerido que os astrócitos possuem um papel importante no controlo de doenças neurodegenerativas incluindo a DP e a sua disfunção tem sido demonstrada em amostras de cérebro humano ou em modelos experimentais da DP. Mutações no gene (PARK7) que codifica para a DJ-1 resultam na perda funcional da proteína causando a forma familiar ou esporádica da DP, assim, a elucidação da função fisiológica da proteína contribuirá para importantes avanços no conhecimento da DP. A DJ-1 é uma proteína multifuncional que se encontra expressa tanto em neurónios como em astrócitos, sendo que, de todas as funções que lhe são atribuídas, a mais relevante para a DP é o seu papel neuroprotetor, provavelmente devido ao seu envolvimento na proteção contra o stress oxidativo funcionando como um sensor, uma vez que, a sua atividade é regulada pelo seu estado oxidativo e por esse motivo, a sobre-oxidação corresponde à forma inativa da proteína. Estudos postmortem realizados em cérebros de doentes com DP esporádica demonstraram que a DJ-1 é abundantemente expressa em astrócitos reativos. Dadas as propriedades neuroprotetoras anti-oxidantes e anti-apoptóticas da DJ-1, este aumento de expressão pode representar um mecanismo protetor compensatório, visto inúmeros estudos demonstrarem que a DJ-1 tem a capacidade de proteger os neurónios contra insultos tóxicos ou oxidativos. A vulnerabilidade neuronal presente nos processos neurodegenerativos associados à DP pode não resultar apenas da disfunção dos mecanismos neuronais mas, por outro lado, resultar da alteração das funções astrocitárias ou mesmo da interação neurónio-astrócito. Tendo em conta estes fatos, o objetivo deste estudo foi determinar como a interação neurónio-astrócito influencia a expressão da DJ-1 quando o stress oxidativo está presente e de que forma essa expressão contribui para a neuroprotecção. Assim, de forma a atingir o objetivo proposto, determinámos a expressão da DJ-1 em culturas primárias de astrócitos ou de neurónios do mesencéfalo ventral e em coculturas neurónio-astrócito expostas a concentrações crescentes de H2O2. Da observação dos resultados, concluímos que, tal como anteriormente descrito, a DJ-1 é expressa em todos os tipos de culturas embora não se tenham verificado aumentos significativos nos níveis intracelulares da proteína com o aumento da concentração de H2O2 utilizada. Além disso, também o contacto entre neurónios e astrócitos apenas através do meio de cultura pareceu não afetar os níveis intracelulares da DJ-1 quando condições controlo foram comparadas com condições oxidativas. Contudo esta abordagem não nos permitiu confirmar qual o perfil de secreção da DJ-1 para o meio de cultura perante um insulto oxidativo, como previamente descrito, ou a influência dessa secreção na proteção neuronal. Dada a necessidade de clarificar a influência da secreção da DJ-1 na sobrevivência neuronal, realizámos as culturas anteriormente descritas, mas adicionámos em simultâneo com o estímulo de H2O2 um anti-corpo anti-DJ-1, para promover a imunodepleção da DJ-1. Os resultados mostraram que o stress oxidativo provocado pela exposição a H2O2 levou ao aumento da morte dopaminérgica sendo a extensão da morte provocada por este estímulo significativamente maior quando se promoveu o bloqueio da DJ-1 presente no meio, o que sugere que a DJ-1 contribui significativamente para a proteção mediada pelos astrócitos. Uma vez provada a importância da DJ-1 secretada para o meio de cultura na neuroproteção mediada pelos astrócitos, o próximo passo foi verificar se os neurónios teriam a capacidade de endocitar a DJ-1 aplicada exogenamente, e marcada com um fluoróforo de modo a que pudesse ser seguida a sua posição. A análise de fluorescência em conjunto com a marcação por imunocitoquímica para a DJ-1 permitiu concluir que, de facto, os neurónios têm a capacidade de endocitar a DJ-1 exógena, podendo ser através deste mecanismo que a proteína exerce as suas funções intracelulares. A análise destes resultados permitiu-nos sugerir que possivelmente a DJ-1 possa ser secretada pelos astrócitos para o meio de cultura quando estes são estimulados por um insulto oxidativo, neste caso H2O2, sendo consequentemente endocitada pelos neurónios, onde exercem a sua ação, direta ou indireta na proteção neuronal mediada pelos astrócitos.
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Keywords
Astrócitos Dj-1 Doença de Parkinson H2o2 Neuroproteção Stress Oxidativo