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Authors
Abstract(s)
The present dissertation results from a six-month internship conducted in Ghent, Belgium,
at MRM Health NV, as part of the Master's program in Biotechnology at the University of
Beira Interior. The primary focus of this internship was to expand company’s database using
MALDI-ToF MS as a robust and efficient tool for bacterial identification.
Throughout the internship and subsequently, for the development of the internship report,
the main objective was defined as integration and active participation within the discovery
team. This involved engaging in daily routine tasks, particularly focusing on the
identification and creation of Main Spectra Profiles (MSPs) of bacterial isolates using
MALDI-ToF MS. Additionally, the 16S rRNA gene sequencing technique was employed for
validation, quality assessment, and performance of the identification. Specific
microbiological techniques tailored for anaerobic bacteria were also applied, alongside with
characterisation techniques utilising Biolog Plates - Phenotype Microarrays (PM), to
monitor the growth and metabolic activity of various anaerobic bacteria over time.
In the first part, the description of the company is provided, focusing on its role in
developing therapeutics by harnessing the full potential of the human intestinal
microbiome. The company encompasses various therapeutic programs, including clinical
trials, preclinical studies, and discovery programs.
The second part concentrated on consolidating and comprehending the theoretical concepts
involved in the research project. This segment explores topics, such as the identification and
characterization of anaerobic bacteria using diverse techniques. Subsequently, daily tasks
necessary for the project's completion are mentioned and described. These tasks primarily
involve extending the company's database, entailing the creation of MSPs for different
anaerobic bacteria. For validation, the 16S rRNA gene sequencing technique was employed,
to enable comparison of results between both techniques for improved anaerobic bacteria
identification. Furthermore, the process of characterizing eight (8) anaerobic bacteria using
Biolog Plates (PM1 and PM2) - Phenotype Microarrays has also been delineated.
By employing MALDI-ToF to add new MSPs of well-characterized bacterial isolates to the
company's and Bruker Daltonics' databases, a significant improvement in the identification
of anaerobic bacteria at the genus and species levels was observed. The implementation of
this system substantially expanded the number of anaerobic bacterial species and genera,
which is particularly relevant for species exhibiting high intra-specific variation. However, to maintain the reliability of MALDI-ToF, regular updates of the database are necessary to
keep pace with changes in anaerobic taxonomy and its increasing diversity.
O microbioma intestinal humano, um ecossistema complexo de microrganismos, é crucial para a saúde, sobretudo devido ao papel das bactérias anaeróbias na decomposição dos nutrientes, na modulação imunitária e na produção de metabolitos. As perturbações neste microbioma, conhecidas como disbiose, podem conduzir a doenças crónicas como a doença inflamatória intestinal (IBD), a síndrome do intestino irritável (IBS) e o cancro colorretal. Apesar da sua importância, as bactérias anaeróbias são difíceis de cultivar e identificar devido à sua sensibilidade ao oxigénio, à necessidade de incubação prolongada e à dependência de métodos demorados e dependentes do conhecimento especializado. As técnicas tradicionais de identificação, embora informativas, requerem bastante tempo e muitas vezes têm dificuldades com espécies recém-descobertas. Os métodos moleculares, como a sequenciação do gene 16S rRNA, melhoraram a exatidão da identificação, mas são dispendiosos e complexos. Recentemente, espetrometria de massa de dessorção/ionização por laser assistida por matriz (MALDI-ToF MS) surgiu como uma alternativa mais rápida e fiável, criando perfis únicos de espetros de proteínas para a identificação bacteriana. De facto, o MALDI-ToF MS apresenta-se como uma técnica de ponta para a identificação microbiana rápida apresentando-se como uma ferramenta promissora para o avanço da investigação e das aplicações microbianas em diversos domínios com vantagens como a velocidade, a exatidão e a relação custo-eficácia. No entanto, são também reconhecidos os desafios relacionados com a qualidade da base de dados e a diferenciação de espécies inerentes à MALDI-ToF MS, sendo que a sua precisão depende da qualidade das bibliotecas de referência, que podem ser afetadas pelas condições de crescimento e pela variabilidade da expressão proteica. Este relatório descreve um estágio de seis meses realizado na MRM Health NV em Ghent, Bélgica, no âmbito do programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade da Beira Interior. A MRM Health NV, uma empresa belga de biotecnologia fundada em 2020, é especializada no microbioma intestinal humano de forma a desenvolver terapias inovadoras para vários distúrbios, incluindo doenças inflamatórias, metabólicas e do sistema nervoso central. A sua plataforma CORAL® integra bioinformática, tecnologia de otimização e processos de fabricação escalonáveis para produzir consórcios bacterianos potentes como substâncias medicamentosas individuais. A empresa colabora com parceiros externos, com o objetivo de criar consórcios bacterianos otimizados para restaurar o equilíbrio intestinal. O programa clínico visa principalmente a IBD, em particular a Colite Ulcerosa (CU). O programa clínico MH002 tem como objetivo abordar a CU, visando a disbiose do microbioma intestinal, melhorando potencialmente os resultados dos doentes e reduzindo as complicações a longo prazo. O estágio curricular visava uma integração perfeita no quadro operacional da empresa, com a aquisição de competências laboratoriais avançadas, o fomento da dinâmica de equipa e a promoção da autonomia dos estagiários. Assim, este projeto explorou o MALDI-ToF MS para identificar bactérias anaeróbias associadas ao intestino, validando a sua precisão com a sequenciação do gene 16S rRNA. Durante o estágio, foram utilizadas técnicas avançadas como a cultura de bactérias anaeróbias, MALDI-ToF MS, sequenciação do gene 16S rRNA e Biolog Phenotypic Microarrays (PM), para facilitar a identificação microbiana exata e a avaliação das capacidades metabólicas de bactérias relevantes para a empresa. Além disso, foram realizadas diversas funções laboratoriais e participação ativa em várias tarefas de investigação microbiológica, melhorando as competências práticas e a compreensão neste domínio. Considerando que um dos principais objetivos foi a expansão da base de dados bacteriana da empresa utilizando MALDI-ToF MS, uma ferramenta robusta para a identificação bacteriana. As estirpes bacterianas foram cultivadas, as proteínas extraídas para análise por MALDI-ToF MS e os espectros resultantes incorporados na base de dados interna da empresa. Além disso, a sequenciação do gene 16S rRNA foi utilizada para validar as identificações MALDI-ToF MS, fornecendo dados de validação independentes e aumentando a confiança na base de dados. Adicionalmente, procurou-se caracterizar as bactérias anaeróbias isoladas utilizando PM, o que permitiu obter informações sobre a sua atividade metabólica e padrões de crescimento. Através destas abordagens sistemáticas, as capacidades da empresa na identificação e análise microbiana foram significativamente melhoradas. Assim através de meticulosos procedimentos laboratoriais, foram criadas com sucesso 40 MSPs a partir de 51 estirpes bacterianas selecionadas, expandindo a base de dados microbiana da empresa. Os desafios encontrados durante a criação de MSP, incluindo problemas de calibração e inconsistências de identificação, foram elucidados, e as estratégias utilizadas para os ultrapassar foram destacadas. Além disso, a validação da identificação da MSP foi meticulosamente conduzida através da sequenciação do gene 16S rRNA, garantindo a exatidão dos resultados da MALDI-ToF MS. Entre as 36 MSPs submetidas à sequenciação do gene 16S rRNA, 32 foram confirmadas como exatas ao nível da espécie através da identificação por MALDI-ToF MS. No entanto, para quatro estirpes bacterianas, a identificação não foi verificada, necessitando de técnicas adicionais, como a repetição da sequenciação do gene 16S rRNA, para confirmar a identificação ao nível da espécie, como Choladocola sp., Diplocloster agilis, Intestinimonas massiliensis, and Pseudoflavonifractor sp. Além disso, as PMs foram utilizadas para obter informações sobre as capacidades metabólicas das bactérias, ajudando assim na otimização dos meios de crescimento. Utilizando placas Biolog PM1 e PM2A foi investigada a capacidade de oito estirpes para metabolizar diferentes fontes de carbono. Esta investigação abrangeu Anaerostipes caccae, Agathobacter faecis, Clostridium chartatabidum, Eubacterium ventriosum, Ruminococcus faecis, Thomasclavelia ramosa, Bacteroides sp. e Blautia hansenii. De um modo geral, as metodologias de identificação e caraterização microbiana, particularmente no domínio das bactérias anaeróbias, foram significativamente avançadas pelo projeto de investigação, abrindo caminho para uma melhor investigação e aplicações neste domínio. A conclusão deste relatório de estágio resume as realizações e contribuições significativas feitas no campo da microbiologia, particularmente no que diz respeito à identificação e caraterização de bactérias anaeróbias, através da utilização de técnicas avançadas, tais como MALDI-ToF MS e sequenciação do gene 16S rRNA. Além disso, o perfil metabólico de um subconjunto destas bactérias foi aprofundado, lançando luz sobre as suas capacidades de metabolizar várias fontes de carbono e abrindo caminho para a otimização de meios de cultura que favoreçam o seu crescimento. Em última análise, este relatório de estágio representa um avanço substancial na investigação microbiológica, fornecendo informações valiosas sobre a identificação, caraterização e atividades metabólicas das bactérias anaeróbias, lançando assim as bases para estudos futuros neste domínio.
O microbioma intestinal humano, um ecossistema complexo de microrganismos, é crucial para a saúde, sobretudo devido ao papel das bactérias anaeróbias na decomposição dos nutrientes, na modulação imunitária e na produção de metabolitos. As perturbações neste microbioma, conhecidas como disbiose, podem conduzir a doenças crónicas como a doença inflamatória intestinal (IBD), a síndrome do intestino irritável (IBS) e o cancro colorretal. Apesar da sua importância, as bactérias anaeróbias são difíceis de cultivar e identificar devido à sua sensibilidade ao oxigénio, à necessidade de incubação prolongada e à dependência de métodos demorados e dependentes do conhecimento especializado. As técnicas tradicionais de identificação, embora informativas, requerem bastante tempo e muitas vezes têm dificuldades com espécies recém-descobertas. Os métodos moleculares, como a sequenciação do gene 16S rRNA, melhoraram a exatidão da identificação, mas são dispendiosos e complexos. Recentemente, espetrometria de massa de dessorção/ionização por laser assistida por matriz (MALDI-ToF MS) surgiu como uma alternativa mais rápida e fiável, criando perfis únicos de espetros de proteínas para a identificação bacteriana. De facto, o MALDI-ToF MS apresenta-se como uma técnica de ponta para a identificação microbiana rápida apresentando-se como uma ferramenta promissora para o avanço da investigação e das aplicações microbianas em diversos domínios com vantagens como a velocidade, a exatidão e a relação custo-eficácia. No entanto, são também reconhecidos os desafios relacionados com a qualidade da base de dados e a diferenciação de espécies inerentes à MALDI-ToF MS, sendo que a sua precisão depende da qualidade das bibliotecas de referência, que podem ser afetadas pelas condições de crescimento e pela variabilidade da expressão proteica. Este relatório descreve um estágio de seis meses realizado na MRM Health NV em Ghent, Bélgica, no âmbito do programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade da Beira Interior. A MRM Health NV, uma empresa belga de biotecnologia fundada em 2020, é especializada no microbioma intestinal humano de forma a desenvolver terapias inovadoras para vários distúrbios, incluindo doenças inflamatórias, metabólicas e do sistema nervoso central. A sua plataforma CORAL® integra bioinformática, tecnologia de otimização e processos de fabricação escalonáveis para produzir consórcios bacterianos potentes como substâncias medicamentosas individuais. A empresa colabora com parceiros externos, com o objetivo de criar consórcios bacterianos otimizados para restaurar o equilíbrio intestinal. O programa clínico visa principalmente a IBD, em particular a Colite Ulcerosa (CU). O programa clínico MH002 tem como objetivo abordar a CU, visando a disbiose do microbioma intestinal, melhorando potencialmente os resultados dos doentes e reduzindo as complicações a longo prazo. O estágio curricular visava uma integração perfeita no quadro operacional da empresa, com a aquisição de competências laboratoriais avançadas, o fomento da dinâmica de equipa e a promoção da autonomia dos estagiários. Assim, este projeto explorou o MALDI-ToF MS para identificar bactérias anaeróbias associadas ao intestino, validando a sua precisão com a sequenciação do gene 16S rRNA. Durante o estágio, foram utilizadas técnicas avançadas como a cultura de bactérias anaeróbias, MALDI-ToF MS, sequenciação do gene 16S rRNA e Biolog Phenotypic Microarrays (PM), para facilitar a identificação microbiana exata e a avaliação das capacidades metabólicas de bactérias relevantes para a empresa. Além disso, foram realizadas diversas funções laboratoriais e participação ativa em várias tarefas de investigação microbiológica, melhorando as competências práticas e a compreensão neste domínio. Considerando que um dos principais objetivos foi a expansão da base de dados bacteriana da empresa utilizando MALDI-ToF MS, uma ferramenta robusta para a identificação bacteriana. As estirpes bacterianas foram cultivadas, as proteínas extraídas para análise por MALDI-ToF MS e os espectros resultantes incorporados na base de dados interna da empresa. Além disso, a sequenciação do gene 16S rRNA foi utilizada para validar as identificações MALDI-ToF MS, fornecendo dados de validação independentes e aumentando a confiança na base de dados. Adicionalmente, procurou-se caracterizar as bactérias anaeróbias isoladas utilizando PM, o que permitiu obter informações sobre a sua atividade metabólica e padrões de crescimento. Através destas abordagens sistemáticas, as capacidades da empresa na identificação e análise microbiana foram significativamente melhoradas. Assim através de meticulosos procedimentos laboratoriais, foram criadas com sucesso 40 MSPs a partir de 51 estirpes bacterianas selecionadas, expandindo a base de dados microbiana da empresa. Os desafios encontrados durante a criação de MSP, incluindo problemas de calibração e inconsistências de identificação, foram elucidados, e as estratégias utilizadas para os ultrapassar foram destacadas. Além disso, a validação da identificação da MSP foi meticulosamente conduzida através da sequenciação do gene 16S rRNA, garantindo a exatidão dos resultados da MALDI-ToF MS. Entre as 36 MSPs submetidas à sequenciação do gene 16S rRNA, 32 foram confirmadas como exatas ao nível da espécie através da identificação por MALDI-ToF MS. No entanto, para quatro estirpes bacterianas, a identificação não foi verificada, necessitando de técnicas adicionais, como a repetição da sequenciação do gene 16S rRNA, para confirmar a identificação ao nível da espécie, como Choladocola sp., Diplocloster agilis, Intestinimonas massiliensis, and Pseudoflavonifractor sp. Além disso, as PMs foram utilizadas para obter informações sobre as capacidades metabólicas das bactérias, ajudando assim na otimização dos meios de crescimento. Utilizando placas Biolog PM1 e PM2A foi investigada a capacidade de oito estirpes para metabolizar diferentes fontes de carbono. Esta investigação abrangeu Anaerostipes caccae, Agathobacter faecis, Clostridium chartatabidum, Eubacterium ventriosum, Ruminococcus faecis, Thomasclavelia ramosa, Bacteroides sp. e Blautia hansenii. De um modo geral, as metodologias de identificação e caraterização microbiana, particularmente no domínio das bactérias anaeróbias, foram significativamente avançadas pelo projeto de investigação, abrindo caminho para uma melhor investigação e aplicações neste domínio. A conclusão deste relatório de estágio resume as realizações e contribuições significativas feitas no campo da microbiologia, particularmente no que diz respeito à identificação e caraterização de bactérias anaeróbias, através da utilização de técnicas avançadas, tais como MALDI-ToF MS e sequenciação do gene 16S rRNA. Além disso, o perfil metabólico de um subconjunto destas bactérias foi aprofundado, lançando luz sobre as suas capacidades de metabolizar várias fontes de carbono e abrindo caminho para a otimização de meios de cultura que favoreçam o seu crescimento. Em última análise, este relatório de estágio representa um avanço substancial na investigação microbiológica, fornecendo informações valiosas sobre a identificação, caraterização e atividades metabólicas das bactérias anaeróbias, lançando assim as bases para estudos futuros neste domínio.
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Keywords
Bactérias Anaeróbias Base de Dados Maldi-Tof Ms Perfil de Espetros
Principais (Msp) Sequenciação do Gene 16s Rrna