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Authors
Abstract(s)
Catechol-O-methyltransferase (COMT) has become an interesting biopharmaceutical target due to its possible association to some disorders, particularly to Parkinson’s disease (PD), where the development of new COMT inhibitors lead to an improvement in clinical treatments, which requires great quantities of this enzyme in a highly purified form, preserving its enzymatic activity. Since the 1960s, recombinant human soluble COMT (hSCOMT) has been extensively subjected to several purification strategies. However, some of them presented significant losses of hSCOMT activity and yield as the main drawbacks. Thus, the present work consists of developing retention and elution strategies to capture hSCOMT from complex Komagataella pastoris lysates through a batch method using gellan microspheres as the main capture method. Briefly, hSCOMT lysate was recovered from K. pastoris methanol-induced cultures and the gellan microspheres were formulated by water-in-oil emulsion technique and reinforced with a nickel or magnesium ion solution. The hSCOMT capture on gellan microspheres was performed through the batch method at room temperature (RT) and 4 ºC, using two strategies: the first one was based on the interaction between negative charges of gellan microspheres and hSCOMT positive residues (ionic strategy) and the second one was founded on the affinity of the hSCOMT to the divalent ions of gellan microspheres (affinity strategy). After optimization, the conditions that allowed the best outcomes with both microspheres formulations in the ionic strategy were the hSCOMT binding at pH 4.0 and elution with 500 mM and 100 mM NaCl, pH 6.2, at RT and 4 ºC, respectively. In the affinity strategy with nickel-crosslinker gellan microspheres, high levels of hSCOMT were captured at pH 7.5, containing 10 mM imidazole, which was mainly recovered with 150 mM NaCl and 300 mM imidazole, pH 7.5, at 4 ºC. In the affinity strategy with magnesium-crosslinked gellan microspheres, hSCOMT was practically all retained at pH 5.2, and eluted with 100 mM NaCl, pH 5.2, at RT, or with 250 mM NaCl and 500 mM MgCl2, pH 5.2, at 4 ºC. In conclusion, the present work demonstrated the gellan gum versatility in the microspheres formulation for the capture of hSCOMT, not only extrapolating a cation exchanger strand due to the anionic gellan molecules, but also extrapolating different affinity strategies with the divalent ions used in the microspheres reinforcement, thereby allowing the design of capture strategies more specific, efficient and adequate to the target molecules.
A catecol-O-metiltransferase (COMT) tem sido descrita como um importante alvo biofarmacêutico devido à sua possível associação a algumas doenças neurológicas, nomeadamente a doença de Parkinson (PD), onde o desenvolvimento de novos inibidores da COMT tem levado a melhorias no tratamento da doença. Para o desenvolvimento de inibidores com um melhor perfil terapêutico é fundamental ter disponibilidade de amostras de COMT recombinante com elevado grau de pureza. De modo a satisfazer os requerimentos da indústria farmacêutica, torna-se imperativo implementar novas estratégias de isolamento e purificação céleres e com reprodutibilidade. O método de Batch surge como uma alternativa a técnicas cromatográficas para o isolamento de proteínas, sendo um método simples, rápido e de baixo custo, que tem a peculiaridade de ser altamente flexível em relação à natureza do material que constitui as partículas de captura. A goma de gelana é um exopolissacarídeo aniónico que tem a capacidade de formar géis com diferentes conformações e estrutura em função da concentração de polímero, temperatura, ambiente aquoso e presença de catiões mono e divalentes. Apesar da goma de gelana possuir inúmeras aplicações na indústria alimentar e biofarmacêutica, entre outras, a sua aplicação como uma matriz cromatográfica só começou a ser investigada recentemente devido não só às propriedades já mencionadas, mas também à sua porosidade, hidrofilicidade, elevada capacidade de ligação e aptidão para formar géis resistentes à temperatura e a condições acídicas extremas. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver estratégias de captura da isoforma solúvel humana recombinante da COMT (hSCOMT) obtida de lisados de Komagataella pastoris (K. pastoris) através de um método de Batch com microesferas de gelana, reforçando a sua aplicabilidade no isolamento de biomoléculas e clarificação de amostras. Para atingir tal objetivo, os lisados de hSCOMT foram obtidos de culturas de K. pastoris induzidas por metanol, enquanto que as microesferas de gelana foram formuladas pela técnica de emulsão de água em óleo e reforçadas com uma solução de iões níquel ou magnésio. As microesferas de gelana com níquel e magnésio como crosslinkers foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio, morfologia e presença dos iões usados no crosslinking através de microscopia semiótica, microscopia eletrónica de varrimento e espetroscopia de raio X de energia dispersiva, respetivamente. As duas formulações de microesferas apresentaram uma estrutura uniforme e consistente de forma esférica. No entanto, as microesferas de gelana com magnésio como crosslinker apresentaram um diâmetro médio menor que aquelas formuladas com o ião níquel, uma vez que o magnésio tem um raio atómico maior, ocupando mais espaço entre as moléculas de gelana. Pela mesma razão, o conteúdo de magnésio foi menor do que o de níquel na análise elementar. De seguida, as duas formulações de microesferas de gelana foram aplicadas num método Batch para capturar a proteína hSCOMT através de duas estratégias desenvolvidas à temperatura ambiente (RT) e a 4 ºC: a primeira estratégia foi baseada na interação entre as cargas negativas das microesferas de gelana e os resíduos positivos da proteína hSCOMT (estratégia iónica) e a segunda na afinidade da hSCOMT para os iões divalentes das microesferas de gelana (estratégia de afinidade). Após otimização, as condições que deram origem aos melhores resultados de captura com ambas as formulações de microesferas de gelana na estratégia iónica foram a ligação da hSCOMT a pH 4.0 e eluição com 500 mM e 100 mM NaCl, pH 6.2, a RT e a 4 ºC, respetivamente. Na estratégia de afinidade ainda com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker foram capturados elevados níveis de hSCOMT a pH 7.5 contendo 10 mM imidazole, e foi maioritariamente recuperada com 150 mM NaCl e 300 mM imidazole, pH 7.5, a 4 ºC. No caso das microesferas de gelana com magnésio como crosslinker, níveis elevados da proteína hSCOMT foram capturados a pH 5.2, e eluídos com 100 mM NaCl, pH 5.2, a RT, ou com 250 mM NaCl e 500 mM MgCl2, pH 5.2, a 4 ºC. De forma geral, todas as estratégias demonstraram ótimos resultados tanto à temperatura ambiente como a 4 ºC, permitindo uma retenção quase completa da proteína hSCOMT e a sua recuperação praticamente num único passo, dando origem a amostras bastante clarificadas e enriquecidas em hSCOMT através da eliminação de contaminantes noutros passos. Extrapolando a aplicação destas microesferas na captura de outras proteínas recombinantes, a estratégia de afinidade com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker é mais adequada para proteínas que sejam produzidas com cauda de histidinas. Por outro lado, proteínas que possuam afinidade natural para iões divalentes, estes podem ser incorporados nas esferas, desenvolvendo-se assim uma estratégia de bioafinidade como foi o caso das microesferas com magnésio no presente trabalho. Em conclusão, este trabalho demostrou a versatilidade da goma de gelana na formulação de microesferas para captura da hSCOMT,que permitiu não só extrapolar uma vertente de trocador catiónico devido às moléculas aniónicas de gelana, mas também extrapolar diferentes interações de afinidade com os iões divalentes usados no reforço das microesferas, permitindo assim o design de estratégias de captura mais específicas, eficientes e adequadas à molécula alvo.
A catecol-O-metiltransferase (COMT) tem sido descrita como um importante alvo biofarmacêutico devido à sua possível associação a algumas doenças neurológicas, nomeadamente a doença de Parkinson (PD), onde o desenvolvimento de novos inibidores da COMT tem levado a melhorias no tratamento da doença. Para o desenvolvimento de inibidores com um melhor perfil terapêutico é fundamental ter disponibilidade de amostras de COMT recombinante com elevado grau de pureza. De modo a satisfazer os requerimentos da indústria farmacêutica, torna-se imperativo implementar novas estratégias de isolamento e purificação céleres e com reprodutibilidade. O método de Batch surge como uma alternativa a técnicas cromatográficas para o isolamento de proteínas, sendo um método simples, rápido e de baixo custo, que tem a peculiaridade de ser altamente flexível em relação à natureza do material que constitui as partículas de captura. A goma de gelana é um exopolissacarídeo aniónico que tem a capacidade de formar géis com diferentes conformações e estrutura em função da concentração de polímero, temperatura, ambiente aquoso e presença de catiões mono e divalentes. Apesar da goma de gelana possuir inúmeras aplicações na indústria alimentar e biofarmacêutica, entre outras, a sua aplicação como uma matriz cromatográfica só começou a ser investigada recentemente devido não só às propriedades já mencionadas, mas também à sua porosidade, hidrofilicidade, elevada capacidade de ligação e aptidão para formar géis resistentes à temperatura e a condições acídicas extremas. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver estratégias de captura da isoforma solúvel humana recombinante da COMT (hSCOMT) obtida de lisados de Komagataella pastoris (K. pastoris) através de um método de Batch com microesferas de gelana, reforçando a sua aplicabilidade no isolamento de biomoléculas e clarificação de amostras. Para atingir tal objetivo, os lisados de hSCOMT foram obtidos de culturas de K. pastoris induzidas por metanol, enquanto que as microesferas de gelana foram formuladas pela técnica de emulsão de água em óleo e reforçadas com uma solução de iões níquel ou magnésio. As microesferas de gelana com níquel e magnésio como crosslinkers foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio, morfologia e presença dos iões usados no crosslinking através de microscopia semiótica, microscopia eletrónica de varrimento e espetroscopia de raio X de energia dispersiva, respetivamente. As duas formulações de microesferas apresentaram uma estrutura uniforme e consistente de forma esférica. No entanto, as microesferas de gelana com magnésio como crosslinker apresentaram um diâmetro médio menor que aquelas formuladas com o ião níquel, uma vez que o magnésio tem um raio atómico maior, ocupando mais espaço entre as moléculas de gelana. Pela mesma razão, o conteúdo de magnésio foi menor do que o de níquel na análise elementar. De seguida, as duas formulações de microesferas de gelana foram aplicadas num método Batch para capturar a proteína hSCOMT através de duas estratégias desenvolvidas à temperatura ambiente (RT) e a 4 ºC: a primeira estratégia foi baseada na interação entre as cargas negativas das microesferas de gelana e os resíduos positivos da proteína hSCOMT (estratégia iónica) e a segunda na afinidade da hSCOMT para os iões divalentes das microesferas de gelana (estratégia de afinidade). Após otimização, as condições que deram origem aos melhores resultados de captura com ambas as formulações de microesferas de gelana na estratégia iónica foram a ligação da hSCOMT a pH 4.0 e eluição com 500 mM e 100 mM NaCl, pH 6.2, a RT e a 4 ºC, respetivamente. Na estratégia de afinidade ainda com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker foram capturados elevados níveis de hSCOMT a pH 7.5 contendo 10 mM imidazole, e foi maioritariamente recuperada com 150 mM NaCl e 300 mM imidazole, pH 7.5, a 4 ºC. No caso das microesferas de gelana com magnésio como crosslinker, níveis elevados da proteína hSCOMT foram capturados a pH 5.2, e eluídos com 100 mM NaCl, pH 5.2, a RT, ou com 250 mM NaCl e 500 mM MgCl2, pH 5.2, a 4 ºC. De forma geral, todas as estratégias demonstraram ótimos resultados tanto à temperatura ambiente como a 4 ºC, permitindo uma retenção quase completa da proteína hSCOMT e a sua recuperação praticamente num único passo, dando origem a amostras bastante clarificadas e enriquecidas em hSCOMT através da eliminação de contaminantes noutros passos. Extrapolando a aplicação destas microesferas na captura de outras proteínas recombinantes, a estratégia de afinidade com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker é mais adequada para proteínas que sejam produzidas com cauda de histidinas. Por outro lado, proteínas que possuam afinidade natural para iões divalentes, estes podem ser incorporados nas esferas, desenvolvendo-se assim uma estratégia de bioafinidade como foi o caso das microesferas com magnésio no presente trabalho. Em conclusão, este trabalho demostrou a versatilidade da goma de gelana na formulação de microesferas para captura da hSCOMT,que permitiu não só extrapolar uma vertente de trocador catiónico devido às moléculas aniónicas de gelana, mas também extrapolar diferentes interações de afinidade com os iões divalentes usados no reforço das microesferas, permitindo assim o design de estratégias de captura mais específicas, eficientes e adequadas à molécula alvo.
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Keywords
Affinity Batch Method Catechol-O-Methyltransferase Gellan Microspheres