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Estudo das interações entre intercaladores e pDNA para terapia molecular
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias | por |
| dc.contributor.advisor | Cruz, Carla Patrícia Alves Freire Madeira | |
| dc.contributor.advisor | Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira | |
| dc.contributor.author | Proenca, Zelia Patricia Cordeiro | |
| dc.date.accessioned | 2018-09-05T13:37:19Z | |
| dc.date.available | 2018-09-05T13:37:19Z | |
| dc.date.issued | 2014-10-31 | |
| dc.date.submitted | 2014-10-2 | |
| dc.description.abstract | Nas últimas décadas o desenvolvimento da terapia genética e a produção de vacinas de DNA têm sido promissores para tratar e controlar determinadas patologias através da transferência de genes. O DNA plasmídico (pDNA) tem sido utilizado como vetor não viral com intuito terapêutico, nomeadamente a conformação superenrolada (sc). Têm sido propostas várias metodologias para a sua purificação, nomeadamente processos baseados na cromatografia de afinidade (AC), pois esta é considerada específica para a separação da isoforma sc, através do reconhecimento bioespecífico do ligando imobilizado. O presente estudo descreve a síntese e caracterização de ligandos aromáticos derivados de naftaleno e piridina e posterior imobilização na matriz Sepharose®. A caracterização do suporte ligando A-Sepharose® foi realizada por ressonância magnética de alta resolução de ângulo mágico (HR-MAS RMN) de modo a avaliar se o ligando foi covalentemente ligado à matriz. A afinidade entre os ligandos, 3,8-diamino-6-fenilfenantridina (DAPP), ligando A e ligando D e as isoformas do plasmídeo pVAX1-LacZ (sc e linear (ln)) foi determinada por ressonância plasmónica de superfície (RPS). A caracterização das interações biomoleculares entre os suportes ligando A e DAPP e os mononucleótidos foi realizada por ressonância magnética nuclear - diferença de transferência de saturação (RMN-STD). Os resultados de RMN-STD mostram que o 5'-CMP e os 3'- 5'-AMP interagem com os suportes DAPP-Sepharose® e ligando A-Sepharose®, preferencialmente pelas bases, sugerindo empilhamento p-p entre os anéis aromáticos dos ligandos e os mononucleótidos. O 5'-TMP interage preferencialmente pelo grupo metilo sugerindo interações hidrofóbicas com ambos os suportes. Contrariamente, o 5'-GMP interage com o suporte DAPP-Sepharose® pela desoxirribose sugerindo interações hidrofóbicas e de van der Waals. Através da análise por RPS verificou-se que o ligando DAPP interage apenas com as isoformas (sc e ln) na presença do tampão acetato de sódio 10 mM a pH 5 e às temperaturas 10° C e 25 °C. Verificou-se ainda, que o ligando A apresenta maior afinidade em Tris-HCl (KD=8,65x10-8±1,0x10-8 M) a 25 °C para a isoforma sc, enquanto que o DAPP tem maior afinidade em acetato de sódio (KD=5,77x10-9±3,1x10-9 M) a 25 °C para a isoforma ln. Relativamente ao ligando D, verificou-se que às temperaturas 10° C e 25 °C não há diferença significativa na afinidade para as duas isoformas. Deste modo os resultados apresentados sugerem que o ligando A é promissor para ser utilizado em AC na purificação de plasmídeos. | por |
| dc.description.abstract | In the last decades the development of gene therapy and the production of DNA vaccines have been promising to treat and control some diseases by gene transference. Plasmid DNA (pDNA) has been used as a non-viral vector with a therapeutic purpose, namely the supercoiled conformation (sc). Several methodologies were proposed for its purification namely processes based on affinity chromatography (AC), since it is specific to separate the sc isoform through biospecific recognition of the immobilized ligand. The present study describes the synthesis and characterization of aromatic ligands derived from naphthalene and pyridine and subsequent immobilization in Sepharose® matrix. The characterization of the ligand A-Sepharose® support was performed by a high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (HR-MAS NMR) spectroscopy in order to evaluate if the ligand was covalently bound to the matrix. The affinity between the 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP), ligand A and ligand D and the isoforms of the pVAX1-LacZ plasmid (sc and linear (ln)) was determined by surface plasmon resonance (SPR). The characterization of biomolecular interactions between the ligand A and DAPP supports and mononucleotides was accomplished by saturation transfer difference nuclear magnetic resonance (STD-NMR). The STD-NMR results showed that the 5'-CMP and 3'- 5'-AMP interact with DAPP-Sepharose® and ligand A-Sepharose® supports, namely by the bases, suggesting p-p stacking between the aromatic rings of ligands and mononucleotides. The 5'-TMP interacts preferentially by the methyl group suggesting hydrophobic interactions with both supports. In contrast, the 5'-GMP interacts with the DAPP-Sepharose® support by the deoxyribose suggesting hydrophobic and van der Waals interactions. By SPR analysis it was found that the ligand DAPP only interacts with isoforms (sc and In) in the presence of 10 mM sodium acetate buffer pH 5 at 10 °C and 25 °C. It was also found that the ligand A has a higher affinity in Tris-HCl (KD =8,65x10-8±1,0x10-8 M) at 25 °C for sc isoform, while DAPP has the higher affinity in sodium acetate (KD=5,77x10-9±3,1x10-9 M) at 25 °C for ln isoform. Relatively to ligand D, it was found that there is no significant difference in affinity for the two isoforms at 10 °C and 25 °C. Thus, the presented results suggest that the ligand A is promising to be used in AC for the purification of plasmids. | eng |
| dc.identifier.tid | 201328909 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/6177 | |
| dc.language.iso | por | por |
| dc.subject | Cromatografia de Afinidade | por |
| dc.subject | Dna Plasmídico | por |
| dc.subject | Intercaladores de Dna. | por |
| dc.subject | Ligandos de Afinidade | por |
| dc.subject | Rmn-Std | por |
| dc.subject | Rps | por |
| dc.subject | Terapias Moleculares | por |
| dc.title | Estudo das interações entre intercaladores e pDNA para terapia molecular | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Biotecnologia | por |
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