Publicação
Pesquisa e identificação de compostos bioativos em plantas florestais
| dc.contributor.advisor | Domingues, Fernanda da Conceição | |
| dc.contributor.author | Luís, Ângelo Filipe Santos | |
| dc.date.accessioned | 2015-05-14T09:42:18Z | |
| dc.date.available | 2015-05-14T09:42:18Z | |
| dc.date.issued | 2014-05 | |
| dc.description.abstract | A avaliação científica e experimental das propriedades das plantas, que os ancestrais utilizavam na medicina tradicional, conhece um grande desenvolvimento, nomeadamente na procura de novos compostos com propriedades antioxidantes e anti-microbianas. Os compostos com propriedades antioxidantes podem ser utilizados na medicina no tratamento de patologias, relacionadas com o stresse oxidativo, em alternativa à terapêutica habitual, ou pela indústria alimentar, na confeção de alimentos funcionais, ou como substitutos dos antioxidantes sintéticos. Os compostos anti-microbianos podem ser utilizados no tratamento de infeções por microrganismos resistentes aos antibióticos convencionais e na indústria alimentar na conservação dos alimentos. A área florestal portuguesa ascende aos 3,3 milhões de hectares, o que representa cerca de 38% do território, sendo uma importante fonte de matéria-prima com potencial atividade biológica. De entre o conjunto de constituintes ativos das plantas, os fenóis e os flavonoides têm sido estudados quanto às suas propriedades antioxidantes e de sequestração de radicais livres, assim como na inibição da peroxidação lipídica. As propriedades anti-microbianas destes compostos têm sido referidas, pois estes exercem nas plantas ação protetora contra microrganismos patogénicos. O objetivo geral deste trabalho foi melhorar o conhecimento sobre as atividades biológicas de extratos obtidos a partir de espécies vegetais existentes no ecossistema da Serra da Estrela (Echinospartum ibericum, Pterospartum tridentatum, Juniperus communis, Ruscus aculeatus, Rubus ulmifolius, Hakea sericea, Cytisus multiflorus, Crataegus monogyna, Erica arborea, Ipomoea acuminata e Ailanthus altissima), e de definir procedimentos para a sua extração e valorização como produtos naturais para uso terapêutico e/ou nutracêutico. Assim, com este trabalho pretendeu estudar-se as propriedades antioxidantes, anti-microbianas e citotóxicas de extratos das diversas partes aéreas (caules, folhas, flores e frutos) dos arbustos mencionados, e analisar o respetivo perfil fitoquímico, no que respeita a algumas classes de metabolitos secundários (fenóis, flavonoides, taninos e alcaloides). O método do reagente de Folin-Ciocalteu foi utilizado para a determinação do teor de fenóis totais e os taninos foram precipitados, a partir destes, com polivinilpolipirrolidona (PVPP); um método colorimétrico com cloreto de alumínio foi usado para a determinação dos flavonoides, e o método do reagente de Dragendorff foi utilizado para a estimativa dos alcaloides totais. O teste do 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e o sistema β-caroteno/ácido linoleico foram utilizados para avaliar a atividade antioxidante dos extratos. A identificação dos compostos fenólicos presentes nos extratos foi efetuada por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC). A atividade anti-microbiana dos extratos metanólicos de Hakea sericea foi avaliada pelo método da difusão em disco e pela determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC). A atividade anti-biofilme foi avaliada através da quantificação da biomassa total do biofilme utilizando o violeta de cristal, e pela avaliação da atividade metabólica do biofilme pelo método do 3′-{1-[(phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium}-bis (4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid hydrate (XTT) . A citotoxicidade foi avaliada por ensaios de hemólise e pelo teste do 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). A maioria dos extratos dos arbustos estudados apresentou um teor elevado de compostos fenólicos, bem como, propriedades antioxidantes significativas, que são provavelmente devidas à existência dos compostos fenólicos nos extratos, dado que se observou uma correlação linear positiva entre o Índice de Atividade Antioxidante (AAI) e teor de fenóis totais dos extratos. O procedimento de RP-HPLC mostrou que os compostos mais comuns eram os ácidos ferúlico e elágico e a quercetina. Destaca-se que para as espécies Echinospartum ibericum, Hakea sericea e Ipomoea acuminata, não existem estudos fitoquímicos anteriores e não se conhecem utilizações destas plantas na medicina tradicional. No geral, os extratos das folhas têm maior concentração de compostos fenólicos do que as outras partes aéreas dos arbustos. Resultados preliminares demonstraram as potenciais propriedades anti-microbianas da espécie Hakea sericea, que é um arbusto invasivo nas florestas Portuguesas. Neste trabalho foi avaliada a atividade anti-microbiana de extratos de Hakea sericea em várias espécies de microrganismos, incluindo a capacidade de inibição da formação de biofilmes. Adicionalmente foram avaliadas as propriedades citotóxicas destes extratos em células humanas. Para as bactérias Gram-positivas, os valores de MIC dos extratos metanólicos de Hakea sericea variaram entre 0.040 e 0.625mg/mL, enquanto para o extrato dos frutos se obtiveram os menores valores de MIC para várias espécies de microrganismos, nomeadamente, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e estirpes clínicas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA). Os extratos dos caules e dos frutos (2.5mg/mL) erradicaram completamente os biofilmes das estirpes Staphylococcus aureus ATCC 25923, SA 01/10 e MRSA 12/08. Relativamente à toxicidade destes extratos, para as folhas, não foi observada hemólise, e no caso dos caules e dos frutos, apenas se verificou hemólise para concentrações muito elevadas, o que sugere a baixa toxicidade destes extratos. O extrato dos frutos não apresentou nenhum efeito tóxico para as células NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts), no entanto, para as concentrações de 0,017 e 0.008mg/mL, este extrato diminuiu a viabilidade da linha de células cancerígenas MCF-7 (human breast adenocarcinoma cells) em 60%, como os resultados do teste do MTT comprovaram. Após se ter verificado que o extrato metanólico bruto dos frutos de Hakea sericea apresentava significativa atividade biológica, procedeu-se ao seu fracionamento bioguiado, o que levou ao isolamento e identificação de um novo alquenilresorcinol, o ácido 9-(3,5-dihidroxi-4-metilfenil)nona-3-(Z)-enóico, composto aqui pela primeira vez descrito. A estrutura deste novo composto foi comprovada por espetroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), de infravermelho (FTIR) e por espetroscopia de massa de alta resolução (HRMS). As propriedades antibacterianas do novo alquenilresorcinol foram estudadas pela determinação dos seus valores de MIC contra várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, utilizando o método da resazurina. O alquenilresorcinol isolado e identificado inibiu o crescimento das bactérias, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes e Bacillus cereus, com valores de MIC de 0.31, 0.02 e 0.16mg/mL, respetivamente. Baixos valores de MIC foram também obtidos contra as estirpes de Staphylococcus aureus (0.005-0.16mg/mL), incluindo os isolados clínicos (SA 01/10 e SA 02/10) e as estirpes de MRSA. Dado que foram identificados nos extratos das plantas estudadas, vários compostos fenólicos, nomeadamente os ácidos gálico, cafeico e clorogénico, e como este grupo de compostos possui diversas atividades biológicas, foram neste trabalho analisadas as suas potenciais propriedades anti-microbianas e anti-biofilme em estirpes de Staphylococcus aureus, bem como o seu mecanismo de ação. Concluiu-se que estes ácidos fenólicos têm propriedades antiestafilocócicas, por exemplo, o ácido gálico influenciou as propriedades de adesão das células de Staphylococcus aureus. A produção de α-hemolisinas por estes microrganismos também foi inibida pelos ácidos gálico e cafeico. Em relação ao seu mecanismo de ação, o ácido cafeico interfere na estabilidade da membrana e com a atividade metabólica das células de Staphylococcus aureus. Em suma, este trabalho, contribuiu para o melhor conhecimento das propriedades biológicas de diversas espécies vegetais, valorizando algumas para as quais não é conhecida nenhuma aplicação na medicina tradicional, nomeadamente Echinospartum ibericum, Ailanthus altissima, Hakea sericea. Por outro lado, permitiu isolar de uma espécie invasora, um novo alquenilresorcinol com propriedades anti-microbianas, permitindo deste modo contribuir para a valorização da biomassa florestal e para a descoberta de um potencial novo antibiótico. | por |
| dc.description.abstract | Fueled by the search for new compounds with antioxidant and antimicrobial activities, the scientific and experimental evaluation of the properties of plant already used by our ancestors in traditional medicine, as seen a great development in recent years. Such compounds can be used as an alternative or together with more traditional therapies to treat oxidative stress related pathologies or in the food industry, for the production of functional foods, or as a substitute for synthetic antioxidants. The antimicrobial compounds can be used to treat infections by microorganisms resistant to conventional antibiotics, or they can be used in the food industry, for food preservation. The Portuguese forest area amounts to 3.3 million hectares, which represents about 38% of the territory, and can be seen as an important source of raw material with potential biological activity. Among the set of possible active plant constituents, phenols and flavonoids have been studied due to their antioxidant properties and ability to sequestrate of free radicals as well as for the inhibition of lipid peroxidation. In addition it is known that these compounds exert in plants a protective action against pathogenic microorganisms, thus indicating potential antimicrobial properties. The aim of this work was to improve the knowledge on the biological properties of plant extracts obtained from naturally occurring species in the Serra da Estrela ecosystem (Echinospartum ibericum, Pterospartum tridentatum, Juniperus communis, Ruscus aculeatus, Rubus ulmifolius, Hakea sericea, Cytisus multiflorus, Crataegus monogyna, Erica arborea, Ipomoea acuminata and Ailanthus altissima), and to define procedures for their extraction and recovery as natural products for therapeutic and/or nutraceutical use. This work focused then on studying the antioxidant, antimicrobial and cytotoxic properties of the extracts of various aerial parts (stems, leaves, flowers and fruits) of the mentioned shrubs, and to analyze their phytochemical profile, with respect to some classes of secondary metabolites (phenols, flavonoids, tannins and alkaloids). The method of Folin-Ciocalteu was used to determine the total phenols, and tannins were precipitated from these with polyvinylpolypyrrolidone (PVPP). A colorimetric method with aluminum chloride was used for the determination of flavonoids and the Dragendorff's reagent method was used for the estimation of total alkaloids. The 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) method and β-carotene bleaching test were used to evaluate the antioxidant activity of the extracts. The identification of phenolic compounds present in the extracts was performed by reversed-phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The antimicrobial activity of methanolic extracts of Hakea sericea was evaluated by the disk diffusion method and the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was determined. The antibiofilm activity was evaluated by measuring the total biomass of biofilms using the crystal violet assay, and the metabolic activity of the biofilm was assessed by the method of 3′-{1- [(phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium}-bis (4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid hydrate (XTT). Cytotoxicity was assessed by hemolysis assays and by the test of 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Most of the studied shrubs extracts showed a high content of phenolic compounds, as well as significant antioxidant properties. Since a positive linear correlation between the Antioxidant Activity Index (AAI) and the total phenolic content of the extracts was observed, antioxidant properties are probably due to the presence of phenolic compounds in the extracts. The procedure of RP-HPLC showed that the most common compounds were ferulic and ellagic acids and quercetin. It is noteworthy that for the species Echinospartum ibericum, Hakea sericea and Ipomoea acuminata, there were no previous phytochemical studies and no known uses of these plants in traditional medicine. Overall, the extracts of the leaves had higher concentrations of phenolic compounds than other aerial parts of the shrubs. Preliminary results demonstrated the potential antimicrobial properties of Hakea sericea, which is an invasive shrub in Portuguese forests. In this study the antimicrobial activity of Hakea sericea extracts was evaluated against various species of microorganisms, including the ability to inhibit the formation of biofilms. In addition the cytotoxic properties of these extracts were evaluated in human cells. For Gram-positive bacteria, MIC values of Hakea sericea methanolic extracts ranged between 0.040 and 0.625mg/mL, whereas fruit extract showed the lowest MIC values for various species of microorganisms, including Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes and clinical methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus (MRSA). The stems and fruits extracts (2.5mg/mL) completely eradicated Staphylococcus aureus ATCC 25923, SA 01/10 and MRSA 12/08 biofilms. Regarding the toxicity of these extracts, for the leaves, no hemolysis was observed and in the case of stems and fruits, hemolysis was observed only at very high concentrations, suggesting the low toxicity of these extracts. The fruits extract did not show any toxic effect for NHDF cells (Normal Human Dermal Fibroblasts), however, for concentrations of 0.017 and 0.008mg/mL, it reduced the viability of cancer cell line MCF-7 (human breast adenocarcinoma cells) by 60%, as the results of the MTT assay confirmed. Having noted that the crude methanolic extract of Hakea sericea fruits showed significant biological activity, we proceeded to its bioassay-guided fractionation, which led to the isolation and identification of a new alkenylresorcinol, the 9-(3,5-dihydroxy-4- methylphenyl)nona-3(Z)-enoic acid, compound described here for the first time. The structure of this novel compound was confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), infrared spectroscopy (FTIR) and high resolution mass spectroscopy (HRMS). The antibacterial properties of the new alkenylresorcinol were studied, determining their MIC values against various Gram-positive and Gram-negative bacteria, using the method of resazurin. This alkenylresorcinol inhibited the growth of bacteria, namely, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus, with MIC values of 0.31, 0.02 and 0.16mg/mL, respectively. Low MIC values were also obtained against strains of Staphylococcus aureus (0.005-0.16mg/mL) including clinical isolates (SA 01/10 and SA 02/10) and MRSA strains. Since several phenolic compounds, including gallic, caffeic and chlorogenic acids have been identified in the plant extracts studied in this work, and as this group of compounds have diverse biological activities, their potential antimicrobial and anti-biofilm properties against Staphylococcus aureus strains, as well as, their mechanism of action were analyzed. It was concluded that these phenolic acids have antistaphylococcal properties, for instance, gallic acid influences the adhesion properties of Staphylococcus aureus cells. The α-hemolysin production by these microorganisms was also inhibited by gallic and caffeic acids. Regarding its mechanism of action, caffeic acid interferes with membrane stability and metabolic activity of Staphylococcus aureus cells. In sum, this work has contributed to a better understanding of the biological properties of several plant species, giving value to some for which there was no known application in traditional medicine, including Echinospartum ibericum, Ailanthus altissima and Hakea sericea. In addition, it made possible to isolate from an invasive species, a new alkenylresorcinol with antimicrobial properties. Thereby raising interest in further studies of forest biomass and allowing the discovery of a potentially new antibiotic. | |
| dc.description.sponsorship | Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) | por |
| dc.identifier.tid | 101377975 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/3341 | |
| dc.language.iso | por | por |
| dc.relation | Bolsa de Doutoramento FCT: Pesquisa e Identificação de Compostos Bioactivos em Plantas Florestais [SFRH/BD/65238/2009] | |
| dc.subject | Plantas - Propriedades biológicas - Compostos fenólicos | por |
| dc.subject | Plantas - Propriedades anti-oxidantes | por |
| dc.subject | Plantas - Propriedades anti-microbianas | por |
| dc.subject | Plantas - Parque Natural da Serra da Estrela - Uso terapêutico | por |
| dc.subject | Plantas - Parque Natural da Serra da Estrela - Uso nutracêutico | por |
| dc.title | Pesquisa e identificação de compostos bioativos em plantas florestais | por |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | SFRH/BD/65238/2009 | |
| oaire.awardTitle | Bolsa de Doutoramento FCT: Pesquisa e Identificação de Compostos Bioactivos em Plantas Florestais [SFRH/BD/65238/2009] | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//SFRH%2FBD%2F65238%2F2009/PT | |
| oaire.fundingStream | Bolsa de Doutoramento | |
| person.familyName | Luís | |
| person.givenName | Ângelo Filipe Santos | |
| person.identifier.ciencia-id | 3D14-798B-65D3 | |
| person.identifier.orcid | 0000-0003-0712-6522 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | doctoralThesis | por |
| relation.isAuthorOfPublication | a2d7c872-99db-41e1-9bc9-82c2d47b4661 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | a2d7c872-99db-41e1-9bc9-82c2d47b4661 | |
| relation.isProjectOfPublication | bc7a6995-f9a8-40db-aa87-90b38fe1d875 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | bc7a6995-f9a8-40db-aa87-90b38fe1d875 | |
| thesis.degree.discipline | Química | por |
| thesis.degree.level | Doutor | por |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Bioquímica | por |
Ficheiros
Principais
1 - 1 de 1
A carregar...
- Nome:
- Tese Doutoramento Ângelo Luís.pdf
- Tamanho:
- 23.56 MB
- Formato:
- Adobe Portable Document Format
- Descrição:
- Documento principal
Licença
1 - 1 de 1
Miniatura indisponível
- Nome:
- license.txt
- Tamanho:
- 1.71 KB
- Formato:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Descrição: