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Authors
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Abstract(s)
The earliest descriptions of epilepsy date back to 3000 years B.C., which was, throughout history, linked to divine factors, and only in the mid-nineteenth century it was widely accepted as a pathology originating in the brain. Thus, summarily, epilepsy is a disease of the brain involving recurrent unprovoked seizures, which arise due to an abnormal excessive or synchronous neuronal activity. Although the scientific knowledge has evolved tremendously over the last decades, particularly in the field of neurosciences, it is believed that we are still far from knowing in detail the neurobiochemical and molecular phenomena intrinsic to the complexity of the processes underlying this disease. In fact, a deeper understanding of the mechanisms that lead to the development of epilepsy (epileptogenesis) and those underlying the ictogenesis will be certainly favorable to find novel therapeutic approaches, capable of improving the suppression of seizures, particularly in patients who develop phenotypes of drug-resistant epilepsy, but also capable of modifying, and if possible interrupting, the cascade of molecular, structural and functional pathophysiologic changes that occur in brain during epileptogenesis.
Given the scarcity of information on the neurobiological phenomena underlying the pharmacological response, as well as on the biochemical and molecular processes responsible for drug resistance and epileptogenesis, new studies are imperative to contribute to increase knowledge about these topics. The involvement of neuromediators in the initiation and spread of epileptic seizures is an increasingly recognized reality and the quantitative determination of these endogenous substances will be fundamental to improve our knowledge at neurobiochemical level, thus enabling a better understanding of the etiopathogenesis of epilepsy and the mechanisms of action of antiepileptic drugs as well. Therefore, in this context, bioanalysis will play a vital role in supporting and helping to interpret the results obtained from many research studies developed in this field. Consequently, the global aim of this doctoral project was to developed simple and reliable bioanalytical tools for the determination of a series of key neuromediators involved in the neurotransmission and neuronal excitability. In addition, the development of a novel bioanalytical tool to simultaneously quantify important antiepileptic drugs and some widely used chemoconvulsant agents was also considered.
Thus, the research work supporting this doctoral thesis began with the development and full validation of an analytical technique of high-performance liquid chromatography coupled to fluorescence detection (HPLC-FLD) for the simultaneous quantification of several catecholamines and related endogenous compounds (i.e., dopamine, norepinephrine, epinephrine, homovanillic acid, levodopa and 3-O-methyldopa) in rat brain tissue. Posteriorly, another methodology using the same analytical system (HPLC-FLD) was also developed for the determination of five neuroactive amino acids (i.e., glutamate, aspartate, taurine, glutamine and gamma-aminobutyric acid) in rat brain tissue; however, in this case, a precolumn derivatization step was required because these amino acids do not have native fluorescence.
Moreover, to perform more integrated analyses of the anticonvulsant and convulsant effects in nonclinical studies it will be essential the availability of bioanalytical tools that enable the simultaneous determination of the target antiepileptic drugs and convulsant agents. Therefore, within the scope of this thesis, it was also developed a liquid chromatography method coupled to diode array detection for the simultaneous determination, in plasma and rat brain samples, three established antiepileptics (levetiracetam, zonisamide and lamotrigine) and two important chemoconvulsant agents (pentylenetetrazole and pilocarpine) frequently used to experimentally induce acute seizures and/or chronic epilepsy in whole-animal models.
This set of bioanalytical tools may allow the study of neurochemical changes that occur in several brain regions associated with epilepsy and/or epileptic seizures, and thus can help to understand multiple aspects still unclear in the field of neurosciences. Hence, the achievements obtained with the work presented in this doctoral thesis may provide quantitative support for future nonclinical studies aimed at deepening the knowledge about the neurobiochemical mechanisms underlying the epileptogenesis and ictogenesis phenomena, as well as the action of antiepileptic drugs and chemoconvulsant agents. Finally, this work represents a small but useful contribution to unravel part of the puzzle of the complex neurobiochemical mechanisms involved in epilepsy.
As primeiras descrições de epilepsia remontam a 3000 anos A.C., a qual, ao longo da história, esteve ligada a fatores divinos e, somente em meados do século XIX, foi amplamente aceite como uma patologia com origem no cérebro. Assim, sumariamente, a epilepsia é uma doença do cérebro que envolve crises não provocadas recorrentes, as quais surgem devido a uma atividade neuronal anormal excessiva ou sincronizada. Embora o conhecimento científico tenha evoluído tremendamente nas últimas décadas, particularmente no campo das neurociências, acredita-se que ainda estamos longe de conhecer detalhadamente os fenómenos neurobioquímicos e moleculares intrínsecos à complexidade dos processos subjacentes a esta doença. De fato, uma compreensão mais profunda dos mecanismos que levam ao desenvolvimento da epilepsia (epileptogénese) e daqueles subjacentes à ictogénese será certamente favorável para encontrar novas abordagens terapêuticas, capazes de melhorar a supressão das crises epiléticas, particularmente em doentes que desenvolvem fenótipos de epilepsia farmacorresistente, mas também capazes de modificar, e se possível interromper, a cascata de alterações fisiopatológicas moleculares, estruturais e funcionais que ocorrem no cérebro durante a epileptogénese. Dada a escassez de informação sobre os fenómenos neurobiológicos subjacentes à resposta farmacológica, bem como sobre os processos bioquímicos e moleculares responsáveis pela resistência a fármacos e pela epileptogénese, novos estudos são imperativos para contribuírem para o aumento do conhecimento acerca destes tópicos. O envolvimento de neuromediadores na iniciação e propagação das crises epiléticas é uma realidade cada vez mais reconhecida e a determinação quantitativa dessas substâncias endógenas será fundamental para melhorar o nosso conhecimento ao nível neurobioquímico, possibilitando uma melhor compreensão da etiopatogénese da epilepsia e também dos mecanismos de ação de fármacos antiepiléticos. Portanto, neste contexto, a bioanálise terá um papel primordial para ajudar a interpretar os resultados obtidos em muitos estudos de investigação desenvolvidos neste campo. Consequentemente, o objetivo global deste projeto de doutoramento foi desenvolver ferramentas bioanalíticas simples e fiáveis para a determinação de uma série de neuromediadores chave envolvidos na neurotransmissão e na excitabilidade neuronal. Além disso, o desenvolvimento de uma nova ferramenta bioanalítica para quantificar simultaneamente fármacos antiepiléticos importantes e alguns agentes quimioconvulsivantes amplamente utilizados foi também considerado. Assim, o trabalho de investigação que sustenta esta tese de doutoramento começou com o desenvolvimento e validação de uma técnica analítica de cromatografia líquida de alta resolução acoplada à deteção por fluorescência (HPLC-FLD) para a quantificação simultânea de várias catecolaminas e compostos endógenos relacionados (dopamina, norepinefrina, epinefrina, ácido homovanílico, levodopa e 3-O-metildopa) em tecido cerebral de rato. Posteriormente, outra metodologia utilizando o mesmo sistema analítico (HPLC-FLD) foi também desenvolvida para a determinação de cinco aminoácidos neuroativos (glutamato, aspartato, taurina, glutamina e ácido gama-aminobutírico) em tecido cerebral de rato; no entanto, neste caso, foi requerido um passo de derivatização pré-coluna porque estes aminoácidos não possuem fluorescência nativa. Além disso, para realizar análises mais integradas dos efeitos anticonvulsivantes e convulsivantes em estudos não clínicos, será imprescindível a disponibilidade de ferramentas bioanalíticas que possibilitem a determinação simultânea dos fármacos antiepiléticos-alvo e de agentes convulsivantes. Portanto, no âmbito desta tese, foi também desenvolvido um método de cromatografia líquida acoplada à deteção por um sistema de díodos para a determinação simultânea, em amostras de plasma e cérebro de rato, três antiepiléticos estabelecidos (levetiracetam, zonisamida e lamotrigina) e dois importantes agentes quimioconvulsivantes (pentilenotetrazol e pilocarpina) frequentemente usados para induzir experimentalmente crises agudas e/ou epilepsia crónica em modelos animais. Este conjunto de ferramentas bioanalíticas pode permitir o estudo de alterações neuroquímicas que ocorrem em várias regiões cerebrais associadas à epilepsia e/ou crises epiléticas, podendo assim ajudar a compreender múltiplos aspetos ainda pouco claros no campo das neurociências. Portanto, os resultados obtidos com os trabalhos apresentados nesta tese de doutoramento podem fornecer suporte quantitativo para futuros estudos não clínicos que visem aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos neurobioquímicos subjacentes aos fenómenos de epileptogénese e de ictogénese, bem como à ação de fármacos antiepiléticos e de agentes quimioconvulsivantes. Finalmente, este trabalho representa uma contribuição pequena, mas útil, para desvendar parte do puzzle dos mecanismos neurobioquímicos complexos envolvidos na epilepsia.
As primeiras descrições de epilepsia remontam a 3000 anos A.C., a qual, ao longo da história, esteve ligada a fatores divinos e, somente em meados do século XIX, foi amplamente aceite como uma patologia com origem no cérebro. Assim, sumariamente, a epilepsia é uma doença do cérebro que envolve crises não provocadas recorrentes, as quais surgem devido a uma atividade neuronal anormal excessiva ou sincronizada. Embora o conhecimento científico tenha evoluído tremendamente nas últimas décadas, particularmente no campo das neurociências, acredita-se que ainda estamos longe de conhecer detalhadamente os fenómenos neurobioquímicos e moleculares intrínsecos à complexidade dos processos subjacentes a esta doença. De fato, uma compreensão mais profunda dos mecanismos que levam ao desenvolvimento da epilepsia (epileptogénese) e daqueles subjacentes à ictogénese será certamente favorável para encontrar novas abordagens terapêuticas, capazes de melhorar a supressão das crises epiléticas, particularmente em doentes que desenvolvem fenótipos de epilepsia farmacorresistente, mas também capazes de modificar, e se possível interromper, a cascata de alterações fisiopatológicas moleculares, estruturais e funcionais que ocorrem no cérebro durante a epileptogénese. Dada a escassez de informação sobre os fenómenos neurobiológicos subjacentes à resposta farmacológica, bem como sobre os processos bioquímicos e moleculares responsáveis pela resistência a fármacos e pela epileptogénese, novos estudos são imperativos para contribuírem para o aumento do conhecimento acerca destes tópicos. O envolvimento de neuromediadores na iniciação e propagação das crises epiléticas é uma realidade cada vez mais reconhecida e a determinação quantitativa dessas substâncias endógenas será fundamental para melhorar o nosso conhecimento ao nível neurobioquímico, possibilitando uma melhor compreensão da etiopatogénese da epilepsia e também dos mecanismos de ação de fármacos antiepiléticos. Portanto, neste contexto, a bioanálise terá um papel primordial para ajudar a interpretar os resultados obtidos em muitos estudos de investigação desenvolvidos neste campo. Consequentemente, o objetivo global deste projeto de doutoramento foi desenvolver ferramentas bioanalíticas simples e fiáveis para a determinação de uma série de neuromediadores chave envolvidos na neurotransmissão e na excitabilidade neuronal. Além disso, o desenvolvimento de uma nova ferramenta bioanalítica para quantificar simultaneamente fármacos antiepiléticos importantes e alguns agentes quimioconvulsivantes amplamente utilizados foi também considerado. Assim, o trabalho de investigação que sustenta esta tese de doutoramento começou com o desenvolvimento e validação de uma técnica analítica de cromatografia líquida de alta resolução acoplada à deteção por fluorescência (HPLC-FLD) para a quantificação simultânea de várias catecolaminas e compostos endógenos relacionados (dopamina, norepinefrina, epinefrina, ácido homovanílico, levodopa e 3-O-metildopa) em tecido cerebral de rato. Posteriormente, outra metodologia utilizando o mesmo sistema analítico (HPLC-FLD) foi também desenvolvida para a determinação de cinco aminoácidos neuroativos (glutamato, aspartato, taurina, glutamina e ácido gama-aminobutírico) em tecido cerebral de rato; no entanto, neste caso, foi requerido um passo de derivatização pré-coluna porque estes aminoácidos não possuem fluorescência nativa. Além disso, para realizar análises mais integradas dos efeitos anticonvulsivantes e convulsivantes em estudos não clínicos, será imprescindível a disponibilidade de ferramentas bioanalíticas que possibilitem a determinação simultânea dos fármacos antiepiléticos-alvo e de agentes convulsivantes. Portanto, no âmbito desta tese, foi também desenvolvido um método de cromatografia líquida acoplada à deteção por um sistema de díodos para a determinação simultânea, em amostras de plasma e cérebro de rato, três antiepiléticos estabelecidos (levetiracetam, zonisamida e lamotrigina) e dois importantes agentes quimioconvulsivantes (pentilenotetrazol e pilocarpina) frequentemente usados para induzir experimentalmente crises agudas e/ou epilepsia crónica em modelos animais. Este conjunto de ferramentas bioanalíticas pode permitir o estudo de alterações neuroquímicas que ocorrem em várias regiões cerebrais associadas à epilepsia e/ou crises epiléticas, podendo assim ajudar a compreender múltiplos aspetos ainda pouco claros no campo das neurociências. Portanto, os resultados obtidos com os trabalhos apresentados nesta tese de doutoramento podem fornecer suporte quantitativo para futuros estudos não clínicos que visem aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos neurobioquímicos subjacentes aos fenómenos de epileptogénese e de ictogénese, bem como à ação de fármacos antiepiléticos e de agentes quimioconvulsivantes. Finalmente, este trabalho representa uma contribuição pequena, mas útil, para desvendar parte do puzzle dos mecanismos neurobioquímicos complexos envolvidos na epilepsia.
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Aminoácidos neuroativos Antiepiléticos Bioanálise Catecolaminas Convulsivantes Cromatografia líquida Epilepsia - Ratos Neuromediadores