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Abstract(s)
Fruits and vegetables are increasingly the focus of scientific studies due to their relevance in terms
of healthy eating, well-being, and medical and therapeutic importance. This highlight is closely
related to the various bioactive compounds present in them, which in turn, gives them notable
antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer and anti-aging properties, as well as protection against
cardiovascular, neurodegenerative and metabolic diseases (diabetes, hypertension, among others).
Among the fruits, blackberries (Rubus and Morus) are one of the summer fruits most appreciated by
consumers, due to their sweet flavor and pleasant aroma, their colour, high percentage of water, and
low fat and calorie content, as well as due to its richness in several bioactive compounds that have
already demonstrated the ability to produce notable physiological and metabolic effects that are
important in the prevention of some pathologies, such as cardiovascular, neurodegenerative
diseases and cancer.
This research project carried out the characterization of 3 similar red fruits highly appreciated by
consumers, which were 2 species of shrub blackberries (R. fruticosus and R. ulmifolius) and 1
species of tree mulberry (M. nigra). Taking into account the increase in their interest and in their
production, which translates into an increase in their economic impact, it was decided to study their
physicochemical characteristics, namely their weight, firmness, acidity, total soluble solids, among
other characteristics, and their nutritional values in order to select the one with the greatest
commercial value and biological potential. Considering the physicochemical data, the length and
width varied between 14.34-20.42 mm and 14.31-25.58 mm, respectively, with the species R.
fruticosus having the greatest length and the species R. ulmifolius the greatest width. The weight
varied between 2.16 g and 7.75 g, with the species R. fruticosus presenting the highest value. On the
other hand, firmness varied from 5.5 N (R. ulmifolius) to 5.6 N (R. fruticosus), while moisture and
ash contents varied between 75.8% (M. nigra) and 79.1% R. fruticosus) and between 97.7% (R.
ulmifolius) and 99.5% (R. fruticosus), respectively. The species R. fruticosus was the one that
exhibited the darkest color.
The phenolic profile was identified by HPLC-DAD-ESI/MSn and quantified by HPLC-DAD. In total,
20 phenolic compounds were determined, including 8 anthocyanins and 12 unstained phenolic
compounds. On the other hand, through ICP-MS and FAAS, a total of 27 minerals were determined,
including 13 essential and 14 non-essential elements. Ca and Mg were the most abundant in all
species, while Pb was found in smaller quantities. A total of 68 volatiles were identified using
SPME/GC-MS, namely 17 aldehydes, 13 alcohols, 3 ketones, 20 esters, 2 furans, 8 hydrocarbons and
5 acids. As expected, qualitative and quantitative differences were observed between species. All
families described influence the nutritional potential, aroma and consumer interest. The initial characterization of blackberries allowed us to conclude that blackberries from Covilhã
region have a good nutritional and bioactive composition, which could be an added value for the
development of new dietary, nutraceutical, pharmaceutical and other products. Furthermore,
qualitative and quantitative differences were found in the parameters evaluated between the
different species. Comparing the values obtained, R. fruticosus appears to be the species with the
most appealing characteristics, both for the consumer and for the products and market.
Then, using the concentrated phenolic extracts of the varieties, obtained by solid phase extraction,
their antioxidant potential was also evaluated, as well as the potential arising from their
combination with the positive control used, which was ascorbic acid. The objective of this last test
was to detect the existence of a possible synergistic interaction, enhancing the activity of both.
In fact, it is common knowledge that cellular metabolism generates nitrogen and oxygen free
radicals necessary for the survival and activity of cells, whose levels are mostly controlled by
intracellular antioxidant enzymes, namely catalase, glutathione peroxide and superoxide dismutase.
However, age, a sedentary lifestyle, smoking and drinking habits, among others, contribute to an
abnormal increase in these species, which can consequently react with proteins, lipids and DNA of
healthy cells, damaging them, thus contributing for the acceleration of aging and the development of
a wide range of diseases, such as cancer, neurodegenerative and cardiovascular diseases, diabetes,
among others. Therefore, to reduce the excessive formation of free radicals and their harmful effects
on the human body, it is essential to adopt a diet rich in antioxidant foods. In fact, a daily intake of
400 g of fruits and vegetables is highly recommended. Therefore, the antioxidant activity of
blackberry extracts was evaluated through in-house tests against the radicals 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH?), nitric oxide (?NO) and superoxide (O2
?-). The species R. fruticosus proved
to be the most active against DPPH? (IC50=34.29 ± 0.55 µg/mL) while the species R. ulmifolius was
the one that revealed the greatest potential in capturing ?NO (IC50=59.49 ± 0.81 µg /mL). On the
other hand, in the O2?-
test, the species M. nigra and R. fruticosus showed the best results
(IC25=14.26 ± 0.47 µg/mL and 14.70 ± 0.58 µg/mL, respectively). Regarding its combination with
the positive control, and among the mixtures made, the combination of the species M. nigra with
ascorbic acid (25:75) was the mixture that showed the greatest activity against DPPH?, revealing an
IC50 of 3.14 ± 0.18 µg/mL, presenting synergistic potential. On the other hand, in terms of activity
against ?NO, the mixture M. nigra + ascorbic acid (75:25) was the most promising (IC50=16.97 ±
0.88 µg/mL). On the other hand, in the O2?- uptake assay, the combination of the species R.
ulmifolius + ascorbic acid (25:75) was the one that proved to be the most promising, presenting an
IC25 value of 7.73 ± 0.33 µg/mL. The data obtained through this study supports the evidence already reported that blackberries have
a promising antioxidant capacity, being able to capture free radicals, and most likely, protect cells
from the damage caused by them.
Finally, the cytotoxicity effects of the extracts were tested, first on normal human dermal fibroblast
(NHDF) cells and then on human Caco-2 colon carcinoma cells. The first evaluation was to select
non-toxic concentrations for non-cancerous cells. With the selected concentrations, the effect of the
extracts on Caco-2 cells was tested. Carrying out this test made it possible to verify that, among the 3
extracts studied, that of the cultivated species R. fruticosus is the one that has the most notable antiproliferative effect. Next, the most promising extract was combined with the anti-tumor drug 5-
fluorouracil (5-FU) in order to understand whether the combination of both would enhance the
effects of inhibiting the growth of Caco-2 cells. With this last test carried out, it was possible to see
that the 50:50 combination between the minimum concentration of 5-FU studied (0.65 µg/mL)
together with the highest concentration of the promising extract tested (800 µg/mL) presents
potential synergistic and highly notable against this studied tumor line. These results may also be
highly promising, encouraging the combination of blackberry and mulberry extracts with new
therapeutic, pharmacological and nutraceutical approaches, as well as their incorporation into
dietary supplements.
As amoras são pequenos frutos de verão, delicados e muito apreciados pelos consumidores devido à sua versatilidade de implementação na alimentação, apreciáveis características organoléticas e riqueza nutricional. De facto, esta pequena baga possui uma cor apelativa, sabor doce, elevado teor em água e baixo conteúdo de carbohidratos. Além das suas características nutricionais apreciáveis numa dieta equilibrada, a presença de compostos bioativos na sua constituição contribui para a promoção de efeitos metabólicos e fisiológicos importantes, sendo expectável algum impacto positivo na prevenção de algumas patologias, tais como cancro, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. Perante as evidências, o interesse do potencial biológico das amoras tem despertado a atenção das comunidades académicas, médicas, produtores e dos consumidores. Tendo em consideração as potenciais propriedades promotoras da saúde das amoras e uma vez que a produção desta fruta também tem vindo a aumentar a nível mundial, em termos científicos é de extrema importância a caraterização físico-química e a avaliação do potencial biológico deste fruto vermelho. Assim sendo, neste trabalho procedeu-se à caracterização físico-química e à avaliação do potencial biológico de três espécies de amoras pretas portuguesas, mais concretamente (i) a amora cultivada (Rubus fruticosus L), (ii) a amora silvestre (Rubus ulmifolius Schott) e (iii) a amora de árvore (Morus nigra L). Tendo em conta os dados físico-químicos obtidos, o comprimento e a largura variaram entre 14,34-20,42 mm e 14,31-25,58 mm, respetivamente, tendo a espécie R. fruticosus apresentado o maior comprimento e a espécie R. ulmifolius a maior largura. O peso variou entre 2,16 a 7,75 g, tendo a espécie R. fruticosus apresentado o valor mais alto. Por outro lado, a firmeza variou de 5,5 N (R. ulmifolius) a 5,6 N (R. fruticosus), enquanto os teores de humidade e cinzas variaram entre 75,8% (M. nigra) e 79,1% (R. fruticosus) e, entre 97,7% (R. ulmifolius) e 99,5% (R. fruticosus), respetivamente. A espécie R. fruticosus foi a que exibiu a cor mais escura. Relativamente ao perfil fenólico obtido por HPLC-DAD-ESI/MSn, foram identificados um total de 20 compostos, nomeadamente 8 antocianinas, 6 flavonóis, 1 ácido hidroxicinâmico, 3 ácidos hidroxibenzóicos e 2 taninos, que foram, posteriormente, quantificados por HPLC-DAD. Nas matrizes de amoras estudadas, a cianidina-3-O-glucósido (2) foi o composto maioritário, com valores que variaram entre 9202,2 µg/g na espécie R. fruticosus e 26845,2 µg/g na espécie R. ulmifolius. Por outro lado, a análise por ICP-MS e FAAS permitiu a identificação de um total de 27 minerais, incluindo 13 essenciais e 14 não-essenciais. O Ca foi o composto predominante em todas as amostras estudadas, enquanto o mineral Pb foi o menos abundante. Tendo em conta o aroma agradável das amoras, o seu conteúdo em compostos voláteis orgânicos foi também explorado por SPME/GC–MS. No total foram identificados 68 elementos, distribuídos por 7 classes, nomeadamente, 17 aldeídos, 13 álcoois, 3 cetonas, 20 ésteres, 2 furanos, 8 hidrocarbonetos e 5 ácidos. Como esperado, foram encontradas diferenças qualitativas e quantitativas dos parâmetros avaliados entre as diferentes espécies. Comparando os valores obtidos, a R. fruticosus aparenta ser a espécie com as características mais apelativas, tanto para o consumidor como para os produtos e mercado. Perante o valor bioativo e fitoquímico apresentado pelas amoras, nomeadamente o seu conteúdo fenólico, e sabendo que o mesmo está intimamente relacionado com o potencial biológico atribuído a este fruto, procedeu-se à obtenção de extratos concentrados nestes compostos. Os mesmos foram obtidos por extração em fase sólida. Numa primeira parte, avaliou-se a atividade antioxidante in vitro destes contra os radicais 1,1-difenil-2-picril-hidrazila (DPPH?), oxido nítrico ( ?NO) e superóxido (O2 ?-). Após a análise dos resultados obtidos, constatou-se que a espécie R. fruticosus foi a mais ativa contra o DPPH?, enquanto a espécie R. ulmifolius foi a mais ativa contra o ?NO (IC50=34,29 ± 0,55 µg/mL e IC50=59,49 ± 0,81 µg/mL, respetivamente). Por outro lado, no ensaio do O2 ?- , foi o extrato rico em fenólicos proveniente da M. nigra aquele que apresentou os resultados mais notáveis, seguido do extrato da R. fruticosus (IC25=14,26 ± 0,47 µg/mL e IC25=14,70 ± 0,58 µg/mL, respetivamente). Adicionalmente, e de maneira a despistar possíveis efeitos sinérgicos, cada um dos três extratos foi ainda combinado com diferentes concentrações do controlo positivo, i.e., ácido ascórbico. De uma forma geral, os resultados obtidos foram muito promissores e incentivam a realização de outros ensaios complementares. Posteriormente, avaliou-se a capacidade citotóxica dos extratos em células provenientes dos fibroblastos (NHDF) de forma a encontrar concentrações não tóxicas para células não-cancerígenas. De seguida, e usando as concentrações selecionadas tendo como base o estudo anterior, foram estudados os possíveis efeitos destas na inibição da proliferação de células de carcinoma Caco-2 do cólon humano. Entre as espécies estudadas, o extrato que apresentou um potencial anticancerígeno mais notável, após exposição por 24 horas, foi o extrato de R. fruticosus. Adicionalmente, e tendo em conta que o uso de moléculas anticancerígenas sintéticas intensifica o surgimento de vários efeitos secundários indesejáveis, foi decido estudar o efeito de um dos fármacos antitumorais sintéticos mais conhecidos, i.e., 5-fluorouracilo, de forma a perceber se a sua combinação com o extrato proveniente da espécie R. fruticosus apresenta potencial sinérgico ou antagónico. Uma vez mais, os resultados obtidos foram bastantes promissores. De uma forma geral, os resultados obtidos neste estudo permitiram concluir que as amoras derivadas das três espécies de plantas estudadas possuem um grande potencial biológico e incentivam a sua incorporação em suplementos alimentares e em novas aplicações terapêuticas, farmacêuticas e nutracêuticas. Todavia, é indispensável a realização de mais estudos, principalmente estudos clínicos e em modelos animais, para demonstrar todo o potencial biológico destas frutas e determinar a dosagem segura a ingerir.
As amoras são pequenos frutos de verão, delicados e muito apreciados pelos consumidores devido à sua versatilidade de implementação na alimentação, apreciáveis características organoléticas e riqueza nutricional. De facto, esta pequena baga possui uma cor apelativa, sabor doce, elevado teor em água e baixo conteúdo de carbohidratos. Além das suas características nutricionais apreciáveis numa dieta equilibrada, a presença de compostos bioativos na sua constituição contribui para a promoção de efeitos metabólicos e fisiológicos importantes, sendo expectável algum impacto positivo na prevenção de algumas patologias, tais como cancro, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. Perante as evidências, o interesse do potencial biológico das amoras tem despertado a atenção das comunidades académicas, médicas, produtores e dos consumidores. Tendo em consideração as potenciais propriedades promotoras da saúde das amoras e uma vez que a produção desta fruta também tem vindo a aumentar a nível mundial, em termos científicos é de extrema importância a caraterização físico-química e a avaliação do potencial biológico deste fruto vermelho. Assim sendo, neste trabalho procedeu-se à caracterização físico-química e à avaliação do potencial biológico de três espécies de amoras pretas portuguesas, mais concretamente (i) a amora cultivada (Rubus fruticosus L), (ii) a amora silvestre (Rubus ulmifolius Schott) e (iii) a amora de árvore (Morus nigra L). Tendo em conta os dados físico-químicos obtidos, o comprimento e a largura variaram entre 14,34-20,42 mm e 14,31-25,58 mm, respetivamente, tendo a espécie R. fruticosus apresentado o maior comprimento e a espécie R. ulmifolius a maior largura. O peso variou entre 2,16 a 7,75 g, tendo a espécie R. fruticosus apresentado o valor mais alto. Por outro lado, a firmeza variou de 5,5 N (R. ulmifolius) a 5,6 N (R. fruticosus), enquanto os teores de humidade e cinzas variaram entre 75,8% (M. nigra) e 79,1% (R. fruticosus) e, entre 97,7% (R. ulmifolius) e 99,5% (R. fruticosus), respetivamente. A espécie R. fruticosus foi a que exibiu a cor mais escura. Relativamente ao perfil fenólico obtido por HPLC-DAD-ESI/MSn, foram identificados um total de 20 compostos, nomeadamente 8 antocianinas, 6 flavonóis, 1 ácido hidroxicinâmico, 3 ácidos hidroxibenzóicos e 2 taninos, que foram, posteriormente, quantificados por HPLC-DAD. Nas matrizes de amoras estudadas, a cianidina-3-O-glucósido (2) foi o composto maioritário, com valores que variaram entre 9202,2 µg/g na espécie R. fruticosus e 26845,2 µg/g na espécie R. ulmifolius. Por outro lado, a análise por ICP-MS e FAAS permitiu a identificação de um total de 27 minerais, incluindo 13 essenciais e 14 não-essenciais. O Ca foi o composto predominante em todas as amostras estudadas, enquanto o mineral Pb foi o menos abundante. Tendo em conta o aroma agradável das amoras, o seu conteúdo em compostos voláteis orgânicos foi também explorado por SPME/GC–MS. No total foram identificados 68 elementos, distribuídos por 7 classes, nomeadamente, 17 aldeídos, 13 álcoois, 3 cetonas, 20 ésteres, 2 furanos, 8 hidrocarbonetos e 5 ácidos. Como esperado, foram encontradas diferenças qualitativas e quantitativas dos parâmetros avaliados entre as diferentes espécies. Comparando os valores obtidos, a R. fruticosus aparenta ser a espécie com as características mais apelativas, tanto para o consumidor como para os produtos e mercado. Perante o valor bioativo e fitoquímico apresentado pelas amoras, nomeadamente o seu conteúdo fenólico, e sabendo que o mesmo está intimamente relacionado com o potencial biológico atribuído a este fruto, procedeu-se à obtenção de extratos concentrados nestes compostos. Os mesmos foram obtidos por extração em fase sólida. Numa primeira parte, avaliou-se a atividade antioxidante in vitro destes contra os radicais 1,1-difenil-2-picril-hidrazila (DPPH?), oxido nítrico ( ?NO) e superóxido (O2 ?-). Após a análise dos resultados obtidos, constatou-se que a espécie R. fruticosus foi a mais ativa contra o DPPH?, enquanto a espécie R. ulmifolius foi a mais ativa contra o ?NO (IC50=34,29 ± 0,55 µg/mL e IC50=59,49 ± 0,81 µg/mL, respetivamente). Por outro lado, no ensaio do O2 ?- , foi o extrato rico em fenólicos proveniente da M. nigra aquele que apresentou os resultados mais notáveis, seguido do extrato da R. fruticosus (IC25=14,26 ± 0,47 µg/mL e IC25=14,70 ± 0,58 µg/mL, respetivamente). Adicionalmente, e de maneira a despistar possíveis efeitos sinérgicos, cada um dos três extratos foi ainda combinado com diferentes concentrações do controlo positivo, i.e., ácido ascórbico. De uma forma geral, os resultados obtidos foram muito promissores e incentivam a realização de outros ensaios complementares. Posteriormente, avaliou-se a capacidade citotóxica dos extratos em células provenientes dos fibroblastos (NHDF) de forma a encontrar concentrações não tóxicas para células não-cancerígenas. De seguida, e usando as concentrações selecionadas tendo como base o estudo anterior, foram estudados os possíveis efeitos destas na inibição da proliferação de células de carcinoma Caco-2 do cólon humano. Entre as espécies estudadas, o extrato que apresentou um potencial anticancerígeno mais notável, após exposição por 24 horas, foi o extrato de R. fruticosus. Adicionalmente, e tendo em conta que o uso de moléculas anticancerígenas sintéticas intensifica o surgimento de vários efeitos secundários indesejáveis, foi decido estudar o efeito de um dos fármacos antitumorais sintéticos mais conhecidos, i.e., 5-fluorouracilo, de forma a perceber se a sua combinação com o extrato proveniente da espécie R. fruticosus apresenta potencial sinérgico ou antagónico. Uma vez mais, os resultados obtidos foram bastantes promissores. De uma forma geral, os resultados obtidos neste estudo permitiram concluir que as amoras derivadas das três espécies de plantas estudadas possuem um grande potencial biológico e incentivam a sua incorporação em suplementos alimentares e em novas aplicações terapêuticas, farmacêuticas e nutracêuticas. Todavia, é indispensável a realização de mais estudos, principalmente estudos clínicos e em modelos animais, para demonstrar todo o potencial biológico destas frutas e determinar a dosagem segura a ingerir.
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Keywords
Amoras Benefícios para a Saúde Compostos Fenólicos Potencial Anticancerígeno Potencial Biológico Propriedades Antioxidantes