| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.24 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Gene Therapy and DNA vaccines are recent therapies that take advantage of the potential of plasmid DNA as a therapeutic molecule for the treatment and cure of several diseases. In the last decade both techniques have received a great deal of attention by pharmaceutical companies due to their simplicity, versatility and safe profile. Hence, the usage of pDNA as biopharmaceutical molecule requires its production at the gram scale, with a high purity and homogeneity level as a vital parameter to ensure a good response and the patient safety.
Anion-exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography have been successfully used in pDNA purification. Nevertheless, the mechanism of pDNA separation for both purification techniques is still not completely understood. A better understanding of the driving forces and mechanisms underlying both purification processes are of great interest to help optimize chromatographic systems.
Flow Microcalorimetry (FMC) has proven its ability to provide an improved understanding of the driving forces, mechanisms and kinetics involved in the interaction process during biomolecules adsorption onto several chromatographic systems]. Thus, using Flow Microcalorimetry as a central technique, this study aims to understand and compare the interaction between different pDNA isoforms (pVAX1-LacZ) and the anion-exchange support (Q-sepharose Fast Flow) or the hydrophobic support (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow), considering only the isotherm linear conditions, showing the role of nonspecific effects on the adsorptive process.
The results obtained in the binding capacity studies revealed that the ln pDNA adsorption process follows a Langmuir isotherm up to a specific ln pDNA equilibrium concentration. In all cases, the binding capacity increases with the plasmid concentration in equilibrium until it reaches a level at which saturation of the chromatographic medium is achieved. The anion-exchange support was found to have a higher binding capacity for ln pDNA adsorption than the hydrophobic interaction support, as expected. FMC results reveled that for both processes the endothermic heat major contributor was suggested to be the desolvation and changes in the solvation shell processes while exothermic heats were related to the interaction (electrostatic attraction) between pDNA and support and also to the secondary adsorption of already adsorbed pDNA molecules. The enthalpies of adsorption showed that the overall adsorption process is mainly enthalpically driven for the adsorption of ln pDNA onto Phenyl Sepharose and entropically driven for the sc pDNA-Q-sepharose system.
A terapia génica e as vacinas de DNA são terapias recentes que aproveitam o potencial do DNA plasmídeo (pDNA) como uma molécula terapêutica para o tratamento e cura de muitas doenças. Na última década, as empresas farmacêuticas deram muita atenção a ambas as técnicas devido à sua simplicidade, versatilidade e segurança. O uso do pDNA como uma molécula com um propósito farmacêutico requer a sua produção em grande escala, com um alto grau de pureza e homogeneidade. Estes parâmetros são fundamentais para garantir uma boa resposta e a segurança do paciente. São utilizados vários processos na purificação de plasmídeos, tanto na eliminação de impurezas como restos celulares, proteínas, DNA genómico, etc., como para separar as diferentes isoformas em que um plasmídeo se pode encontrar (linear, circular aberto ou superenrolado). As propriedades únicas do pDNA fazem com que a sua purificação seja a parte mais complicada de todo o processo de fabrico. A cromatografia de troca aniónica e de interação hidrofóbica são as técnicas utilizadas com mais sucesso na purificação de plasmídeos. Contudo, o mecanismo de separação de plasmídeos por estas técnicas não é totalmente compreendido. É difícil prever o comportamento das moléculas durante a separação, e ainda, os métodos usados na escala laboratorial são economicamente e ambientalmente incompatíveis com a escala industrial. Assim sendo, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à cromatografia terá um elevado interesse prático. A análise dos eventos termodinâmicos dos processos de adsorção através da Microcalorimetria de Fluxo (FMC) tem vindo a provar a sua boa utilidade na obtenção de uma melhor compreensão das forças motrizes, dos mecanismos e das cinéticas envolvidas no processo de adsorção de biomoléculas em diferentes sistemas cromatográficos. Por isso, neste trabalho, através da utilização da microcalorimetria de fluxo, pretende-se compreender e comparar o mecanismo de adsorção de um plasmídeo na sua forma linear (ln pDNA) a um suporte cromatográfico de troca aniónica (Q-sepharose Fast Flow) e a um suporte cromatográfico de interação hidrofóbica (Phenyl-sepharose 6 Fast Flow), e ainda a adsorção de um plasmídeo na sua forma linear e superenrolada (sc pDNA) a um suporte cromatográfico de troca aniónica (Q-sepharose Fast Flow). Os resultados serão analisados dando enfase às diferenças entre cada sistema. Para além da microcalorimetria de fluxo, foram também realizados estudos da capacidade de ligação em modo estático (static binding capacity) para obter uma melhor compreensão do mecanismo de adsorção. Os resultados obtidos nos estudos de capacidade de ligação revelaram que o processo de adsorção do plasmídeo na forma linear segue uma isotérmica de Langmuir até uma certa concentração de plasmídeo em equilíbrio. Em todos os casos testados, a capacidade de ligação do suporte aumenta com o aumento da concentração de plasmídeo em equilíbrio até se atingir um patamar em que a saturação do suporte cromatográfico é alcançada. O suporte de troca iónica revelou ter uma capacidade de ligação maior para o ln pDNA do que o suporte de interação hidrofóbica, como esperado. Não foi possível fazer os mesmos testes com o sc pDNA dado a sua instabilidade nas condições em que os testes são realizados. Não obstante, conseguiu-se de forma teórica chegar a uma previsão da capacidade máxima de ligação do sc pDNA ao suporte de troca aniónica que revelou ser inferior à capacidade teórica atingida na adsorção de ln pDNA. Os estudos realizados utilizando a microcalorimetria de fluxo foram efetuados na zona linear das isotérmicas. Dois modos diferentes de injeção foram utilizados através da introdução de um pulso de amostra na célula do microcalorímetro ou através da alimentação contínua de amostra à célula. Estes modos de injeção foram conseguidos usando loops de diferentes volumes. Considerando os resultados do FMC obtidos com a adsorção do ln pDNA à Phenyl Sepharose, todos os termogramas são compostos por um pico endotérmico seguido de um ou dois picos exotérmicos, dependendo do modo de injeção, e um último pico endotérmico. Os termogramas foram deconvoluidos e as áreas e o timing dos picos considerados na comparação com o processo de adsorção do ln pDNA a Q-Sepharose. O primeiro pico endotérmico relaciona-se com o processo de desolvatação. O primeiro pico exotérmico está associado à interação entre o ln pDNA e o suporte. Visto que este apresenta valores energéticos similares aos da interação do ln pDNA com a Q-Sepharose, verificou-se que a Phenyl Sepharose também interage electrostaticamente com o DNA plasmídeo através de interações anião-?? Utilizando a alimentação contínua da coluna (loop de 430 µL), encontraram-se diferenças não só na magnitude e no timing de cada sinal, como também no perfil do termograma. A presença de diferentes picos num termograma indica a existência de diferentes eventos durante o processo de adsorção. O segundo pico exotérmico, encontrado apenas utilizando o modo de alimentação contínua, está relacionado com adsorção secundária. Este processo também acontece na adsorção do ln pDNA à Q-Sepharose. Considerou-se que o último pico endotérmico estivesse relacionado com a reorganização das moléculas de água e iões na interface do ln pDNA com a solução. Acredita-se que este processo seja causado pela alta concentração de sulfato de amónio na solução. As experiencias realizadas no FMC com sc pDNA e Q-Sepharose resultaram em termogramas compostos por um pico endotérmico seguido de um exotérmico. O pico endotérmico obtido com o loop de 430 µL foi deconvoluidos, posteriormente, em dois sinais endotérmicos. Tal como no caso anterior, as intensidades, áreas e o timing dos sinais foram considerados na comparação com a adsorção do ln pDNA à Q-Sepharose. Acredita-se que o primeiro sinal endotérmico esteja relacionado com processo de desolvatação, tal como na adsorção do ln pDNA. Contudo, verificou-se que o processo é mais energético no caso do sc pDNA dado que este tem uma maior densidade de carga que é conferida pela isoforma superenrola, conduzindo a um maior gasto energético na desolvatação. Ao utilizar o loop de 430 µL conseguiu-se promover uma sobrecarga no volume de amostra que passa na coluna. Este método resultou no aparecimento de um segundo sinal endotérmico. Este sinal relaciona-se com as repulsões entre as moléculas de sc pDNA livres na solução. Por último, a área e o timing do pico exotérmico leva-nos a acreditar que este está relacionado com a reorientação da molécula e com adsorção secundária. As entalpias de adsorção revelaram que o processo global de adsorção é exotérmico (perto de zero) na adsorção do ln pDNA à Phenyl Sepharose. Alguns estudos mostram que os processos cromatográficos que envolvem interações hidrofóbicas são fortemente influenciados pela variação da entropia, e são muitas vezes considerados maioritariamente endotérmicos. Neste caso particular, não temos um processo só com interações hidrofóbicas o que explica a divergência dos resultados. Na adsorção do sc pDNA à Q-Sepharose, o processo global é conduzido entropicamente visto que este é endotérmico para todos os casos estudados, este resultado é similar aos obtidos anteriormente com o estudo da adsorção pela análise de van´t Hoff [24].
A terapia génica e as vacinas de DNA são terapias recentes que aproveitam o potencial do DNA plasmídeo (pDNA) como uma molécula terapêutica para o tratamento e cura de muitas doenças. Na última década, as empresas farmacêuticas deram muita atenção a ambas as técnicas devido à sua simplicidade, versatilidade e segurança. O uso do pDNA como uma molécula com um propósito farmacêutico requer a sua produção em grande escala, com um alto grau de pureza e homogeneidade. Estes parâmetros são fundamentais para garantir uma boa resposta e a segurança do paciente. São utilizados vários processos na purificação de plasmídeos, tanto na eliminação de impurezas como restos celulares, proteínas, DNA genómico, etc., como para separar as diferentes isoformas em que um plasmídeo se pode encontrar (linear, circular aberto ou superenrolado). As propriedades únicas do pDNA fazem com que a sua purificação seja a parte mais complicada de todo o processo de fabrico. A cromatografia de troca aniónica e de interação hidrofóbica são as técnicas utilizadas com mais sucesso na purificação de plasmídeos. Contudo, o mecanismo de separação de plasmídeos por estas técnicas não é totalmente compreendido. É difícil prever o comportamento das moléculas durante a separação, e ainda, os métodos usados na escala laboratorial são economicamente e ambientalmente incompatíveis com a escala industrial. Assim sendo, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à cromatografia terá um elevado interesse prático. A análise dos eventos termodinâmicos dos processos de adsorção através da Microcalorimetria de Fluxo (FMC) tem vindo a provar a sua boa utilidade na obtenção de uma melhor compreensão das forças motrizes, dos mecanismos e das cinéticas envolvidas no processo de adsorção de biomoléculas em diferentes sistemas cromatográficos. Por isso, neste trabalho, através da utilização da microcalorimetria de fluxo, pretende-se compreender e comparar o mecanismo de adsorção de um plasmídeo na sua forma linear (ln pDNA) a um suporte cromatográfico de troca aniónica (Q-sepharose Fast Flow) e a um suporte cromatográfico de interação hidrofóbica (Phenyl-sepharose 6 Fast Flow), e ainda a adsorção de um plasmídeo na sua forma linear e superenrolada (sc pDNA) a um suporte cromatográfico de troca aniónica (Q-sepharose Fast Flow). Os resultados serão analisados dando enfase às diferenças entre cada sistema. Para além da microcalorimetria de fluxo, foram também realizados estudos da capacidade de ligação em modo estático (static binding capacity) para obter uma melhor compreensão do mecanismo de adsorção. Os resultados obtidos nos estudos de capacidade de ligação revelaram que o processo de adsorção do plasmídeo na forma linear segue uma isotérmica de Langmuir até uma certa concentração de plasmídeo em equilíbrio. Em todos os casos testados, a capacidade de ligação do suporte aumenta com o aumento da concentração de plasmídeo em equilíbrio até se atingir um patamar em que a saturação do suporte cromatográfico é alcançada. O suporte de troca iónica revelou ter uma capacidade de ligação maior para o ln pDNA do que o suporte de interação hidrofóbica, como esperado. Não foi possível fazer os mesmos testes com o sc pDNA dado a sua instabilidade nas condições em que os testes são realizados. Não obstante, conseguiu-se de forma teórica chegar a uma previsão da capacidade máxima de ligação do sc pDNA ao suporte de troca aniónica que revelou ser inferior à capacidade teórica atingida na adsorção de ln pDNA. Os estudos realizados utilizando a microcalorimetria de fluxo foram efetuados na zona linear das isotérmicas. Dois modos diferentes de injeção foram utilizados através da introdução de um pulso de amostra na célula do microcalorímetro ou através da alimentação contínua de amostra à célula. Estes modos de injeção foram conseguidos usando loops de diferentes volumes. Considerando os resultados do FMC obtidos com a adsorção do ln pDNA à Phenyl Sepharose, todos os termogramas são compostos por um pico endotérmico seguido de um ou dois picos exotérmicos, dependendo do modo de injeção, e um último pico endotérmico. Os termogramas foram deconvoluidos e as áreas e o timing dos picos considerados na comparação com o processo de adsorção do ln pDNA a Q-Sepharose. O primeiro pico endotérmico relaciona-se com o processo de desolvatação. O primeiro pico exotérmico está associado à interação entre o ln pDNA e o suporte. Visto que este apresenta valores energéticos similares aos da interação do ln pDNA com a Q-Sepharose, verificou-se que a Phenyl Sepharose também interage electrostaticamente com o DNA plasmídeo através de interações anião-?? Utilizando a alimentação contínua da coluna (loop de 430 µL), encontraram-se diferenças não só na magnitude e no timing de cada sinal, como também no perfil do termograma. A presença de diferentes picos num termograma indica a existência de diferentes eventos durante o processo de adsorção. O segundo pico exotérmico, encontrado apenas utilizando o modo de alimentação contínua, está relacionado com adsorção secundária. Este processo também acontece na adsorção do ln pDNA à Q-Sepharose. Considerou-se que o último pico endotérmico estivesse relacionado com a reorganização das moléculas de água e iões na interface do ln pDNA com a solução. Acredita-se que este processo seja causado pela alta concentração de sulfato de amónio na solução. As experiencias realizadas no FMC com sc pDNA e Q-Sepharose resultaram em termogramas compostos por um pico endotérmico seguido de um exotérmico. O pico endotérmico obtido com o loop de 430 µL foi deconvoluidos, posteriormente, em dois sinais endotérmicos. Tal como no caso anterior, as intensidades, áreas e o timing dos sinais foram considerados na comparação com a adsorção do ln pDNA à Q-Sepharose. Acredita-se que o primeiro sinal endotérmico esteja relacionado com processo de desolvatação, tal como na adsorção do ln pDNA. Contudo, verificou-se que o processo é mais energético no caso do sc pDNA dado que este tem uma maior densidade de carga que é conferida pela isoforma superenrola, conduzindo a um maior gasto energético na desolvatação. Ao utilizar o loop de 430 µL conseguiu-se promover uma sobrecarga no volume de amostra que passa na coluna. Este método resultou no aparecimento de um segundo sinal endotérmico. Este sinal relaciona-se com as repulsões entre as moléculas de sc pDNA livres na solução. Por último, a área e o timing do pico exotérmico leva-nos a acreditar que este está relacionado com a reorientação da molécula e com adsorção secundária. As entalpias de adsorção revelaram que o processo global de adsorção é exotérmico (perto de zero) na adsorção do ln pDNA à Phenyl Sepharose. Alguns estudos mostram que os processos cromatográficos que envolvem interações hidrofóbicas são fortemente influenciados pela variação da entropia, e são muitas vezes considerados maioritariamente endotérmicos. Neste caso particular, não temos um processo só com interações hidrofóbicas o que explica a divergência dos resultados. Na adsorção do sc pDNA à Q-Sepharose, o processo global é conduzido entropicamente visto que este é endotérmico para todos os casos estudados, este resultado é similar aos obtidos anteriormente com o estudo da adsorção pela análise de van´t Hoff [24].
Description
Keywords
Adsorção Cromatografia de Interação Hidrofóbica Cromatografia de Troca Aniónica Dna Plasmídeo Linear e Superenrolado Microcalorimetria de Fluxo