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Authors
Abstract(s)
Ischemic stroke is one of the most impactful chronic diseases in the world and a leading cause of disability and death. Due to the lack of therapeutic options, and the limitations of those currently available, it is crucial to find new approaches to prevent and treat ischemic stroke events. This study aimed to exploit simvastatin neuroprotective effects by developing a formulation capable of delivering it to the brain through nasal administration. For that, different formulation strategies of micro and nanoemulsions were pursued, to finally select the most promising to be compared in in vivo studies. To achieve this, an initial screening was conducted to optimize formulation composition, maximizing drug loading capacity while maintaining target nanometric and homogeneous droplet size and neutral to positive zeta potential. Evaluation of shortterm physical stability (drug precipitation upon storage at 4 °C up to 30 days) was combined with the initial screening in order to determine the formulations with the best potential to be further studied. The safety of the selected formulations was tested by hemolysis assays using human blood. An assay for simvastatin quantification was validated using liquid chromatography coupled with UV detection, and long-term physical and chemical stability tests were conducted at three different storage temperatures, 4 °C, 25 °C and 40 °C for 4 months. Preliminary in vitro drug release profiles were characterized using horizontal Ussing Chambers. The nano and microemulsions with the highest potential were also characterized in terms of their osmolality and viscosity, and nanoemulsion’s viscosity was further optimized. Two lead formulations (a microemulsion and a nanoemulsion) were intranasally administered to Wistar rats and compared at 3 time points (30, 120, and 360 min) regarding brain concentrations of both prodrug (simvastatin) and active form (tenivastatin). A second in vivo test was conducted at 4 time points (15, 30, 60, and 360 min) to obtain more data regarding the previously tested micro and nanoemulsions, to determine the impact of nanoemulsion’s viscosity and surface charge on simvastatin’s brain concentrations, and to compare these formulations to a tenivastatin solution. After the different optimizations and tests, a promising nanoemulsion strategy with cetalkonium chloride at 0.5% (w/w) was attained, exhibiting great potential in the in vivo studies. With drug strengths of 5.66% or 7.41% (w/w), this nanoemulsion under refrigeration had extremely low polydispersity index (0.069 and 0.074, respectively), small droplet sizes (117.6 nm and 116.4 nm, respectively) and a zeta potential of +25 mV for the lower drug strength. In terms of short-term physical stability, the nanoemulsion with higher simvastatin concentration only achieved stability for 3 days, but drug precipitation was not observed with the lowest concentration. Assuming the more frequently used simvastatin dose applied in ischemic stroke animal models (20 mg/Kg), and the respective two-fold dose (40 mg/Kg), the formulation proved to be safe regarding its hemolytic potential. The lower drug strength nanoemulsion (5.66%) achieved physical stability for a period of 4 months while stored at 4 °C. Simvastatin's chemical stability when using the nanoemulsion was also prolonged when stored at 4 °C. After osmolality characterization, the nanoemulsion obtained hyperosmotic values, which were considered safer than hypoosmotic values for nasal mucosa. However, to be within the safety range of 300 and 700 mOsm/Kg, the nanoemulsion would need to suffer a dilution between 1.59 and 2.66-fold. In a preliminary drug release test, the nanoemulsion displayed a Higuchi Model release profile. The baseline viscosity of the nanoemulsion at 25 °C was 24.6 mPa·s and increased to 186.2 mPa·s using PVP at 0.25% (w/w). In vivo, the nanoemulsion with cetalkonium chloride at 0.5% achieved the highest simvastatin brain concentration after 30 minutes in both the first (153 ng/mL) and second test (131 ng/mL). The obtained simvastatin brain concentrations might demonstrate some potential to be neuroprotective but, surprisingly, no tenivastatin was detected during the in vivo assays. In conclusion, a promising nanoemulsion with cetalkonium chloride 0.5% was obtained, enabling the possible use of simvastatin’s neuroprotective features in ischemic stroke using intranasal delivery. Further investigation needs to be done regarding the correlation between pharmacokinetic studies and functional studies using ischemic stroke models, to fully elucidate the role of simvastatin/tenivastatin and to improve drug applicability in cerebrovascular disease.
O acidente vascular cerebral isquémico é uma das doenças crónicas com maior impacto mundial e uma das principais causas de morte e incapacidade. Devido ao escasso número de opções terapêuticas e algumas das suas limitações, é necessário encontrar alternativas para prevenir e tratar casos de acidente vascular isquémico. Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma formulação capaz de entregar sinvastatina ao cérebro através da administração nasal, de forma a explorar os efeitos de neuroprotecção da sinvastatina. Diferentes estratégias de formulação em micro e nanoemulsões foram avaliadas de modo a selecionar um grupo promissor a ser comparado em estudos in vivo. Para tal, foi realizado um screening inicial para otimizar a composição das formulações de modo a maximizar a capacidade de incorporação de fármaco, mantendo propriedades como o tamanho de nanométrico e homogéneo de gotícula e potencial zeta neutro a positivo. Fez-se também a avaliação da estabilidade física a curto prazo (análise da precipitação de fármaco durante um armazenamento de 30 dias a 4 °C) para determinar as formulações com maior potencial, e assim serem mais detalhadamente estudadas. A segurança das formulações selecionadas foi testada por ensaios de hemólise usando sangue humano. Foi desenvolvido e validado um ensaio de cromatografia líquida acoplado a deteção UV, para quantificação de sinvastatina usado na avaliação da estabilidade física e química a longo prazo, a três temperaturas de armazenamento diferentes (4 °C, 25 °C e 40 °C durante 4 meses). Os perfis in vitro de libertação do fármaco foram caracterizados com recurso a câmaras de Ussing horizontais. As micro e nanoemulsões com maior potencial foram também caracterizadas quando à sua osmolalidade e viscosidade, tendo a viscosidade sido otimizada nas nanoemulsões. Duas estratégias de formulação (uma microemulsão e uma nanoemulsão) foram administradas por via intranasal em ratos Wistar e comparadas tendo em conta as concentrações cerebrais atingidas, tanto do pró-fármaco (sinvastatina) como da forma ativa (tenivastatina), em três tempos distintos (30, 120 e 360 minutos). Um segundo ensaio in vivo foi realizado de modo a obter resultados mais robustas das duas formulações anteriormente usadas, e também avaliar o papel da viscosidade e carga da nanoemulsão nas concentrações cerebrais de fármaco. As formulações foram também comparadas com uma solução de tenivastatina. Após diferentes estudos e processos de otimização, foi obtida uma nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% (m/m) que demonstrou enorme potencial nos estudos in vivo. Dependendo da concentração de fármaco encapsulada, 5.66% ou 7.41% (m/m) obteve-se uma nanoemulsão extremamente homogénea (PDI igual a 0.069 e 0.074, respetivamente), com pequenos tamanhos de gotícula (117.6 nm e 116.4 nm, respetivamente), após refrigeração da mesma (4 °C). A nanoemulsão apresentou caracter catiónico, com potenciais zeta de aproximadamente + 25 mV. Considerando a estabilidade física a curto prazo, a nanoemulsão com menor quantidade de fármaco obteve estabilidade por um período superior a 30 dias. Já a formulação com maior quantidade de fármaco, apenas obteve estabilidade por 3 dias. A nanoemulsão mostrou segurança considerando a dose de sinvastatina mais usada em modelos animais de acidente vascular isquémico (20 mg/Kg), bem como para a dose duas vezes superior (40 mg/Kg). A formulação mostrou ser fisicamente estável quando armazenada a 4 °C por um período de quatro meses. A estabilidade química da sinvastatina foi também prolongada quando a formulação foi armazenada a 4 °C. Quanto à osmolalidade, a formulação mostrou ser hiperosmótica, sendo mais segura face a soluções hiposmóticas. No entanto a formulação precisaria de uma diluição de 1.59 a 2.66 vezes de modo a obter valores de osmolalidade dentro do intervalo descrito como seguro para aplicação na cavidade nasal (300 a 700 mOsm/Kg). Durante os ensaios de libertação in vitro, verificou-se uma libertação incompleta, potencialmente devida a adsorção de sinvastatina, que poderá ter comprometido os resultados obtidos. É assim necessário avaliar otimizar este modelo in vitro para que melhor caracterizar o perfil de libertação da sinvastatina usando as diferentes formulações. Apesar disso os resultados poderão ser informativos, tendo a nanoemulsão obtido um perfil de libertação segundo o modelo de Higuchi. A 25 °C a nanoemulsão apresentou uma viscosidade de 24.62 mPa·s, que pode ser aumentada para 186.2 mPa·s utilizando PVP a 0.25% (m/m). Nos ensaios farmacocinéticos in vivo, a nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% originou as maiores concentrações cerebrais de sinvastatina após 30 minutos da administração por via intranasal, tanto no primeiro (153 ng/mL) como no segundo teste (131 ng/mL). Ambas as concentrações obtidas poderão ter o potencial de ser neuroprotetores embora, surpreendentemente, não se tenham detetado concentrações cerebrais de tenivastatina durante os ensaios in vivo. Concluindo, foi conseguida uma nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% (m/m) promissora para ser administrada pela via intranasal, de modo a explorar as propriedades neuroprotetoras da sinvastatina no acidente vascular isquémico. Existe ainda a necessidade de desenvolver estudos futuros que consigam correlacionar os resultados obtidos em ensaios farmacocinéticos e em ensaios funcionais usando modelos animais de acidente vascular cerebral isquémico já descritos na literatura, para melhor compreender o papel tanto da sinvastatina como da tenivastatin no acidente vascular isquémico e assim poder melhorar a sua cerebrovascular.
O acidente vascular cerebral isquémico é uma das doenças crónicas com maior impacto mundial e uma das principais causas de morte e incapacidade. Devido ao escasso número de opções terapêuticas e algumas das suas limitações, é necessário encontrar alternativas para prevenir e tratar casos de acidente vascular isquémico. Este trabalho teve como objetivo desenvolver uma formulação capaz de entregar sinvastatina ao cérebro através da administração nasal, de forma a explorar os efeitos de neuroprotecção da sinvastatina. Diferentes estratégias de formulação em micro e nanoemulsões foram avaliadas de modo a selecionar um grupo promissor a ser comparado em estudos in vivo. Para tal, foi realizado um screening inicial para otimizar a composição das formulações de modo a maximizar a capacidade de incorporação de fármaco, mantendo propriedades como o tamanho de nanométrico e homogéneo de gotícula e potencial zeta neutro a positivo. Fez-se também a avaliação da estabilidade física a curto prazo (análise da precipitação de fármaco durante um armazenamento de 30 dias a 4 °C) para determinar as formulações com maior potencial, e assim serem mais detalhadamente estudadas. A segurança das formulações selecionadas foi testada por ensaios de hemólise usando sangue humano. Foi desenvolvido e validado um ensaio de cromatografia líquida acoplado a deteção UV, para quantificação de sinvastatina usado na avaliação da estabilidade física e química a longo prazo, a três temperaturas de armazenamento diferentes (4 °C, 25 °C e 40 °C durante 4 meses). Os perfis in vitro de libertação do fármaco foram caracterizados com recurso a câmaras de Ussing horizontais. As micro e nanoemulsões com maior potencial foram também caracterizadas quando à sua osmolalidade e viscosidade, tendo a viscosidade sido otimizada nas nanoemulsões. Duas estratégias de formulação (uma microemulsão e uma nanoemulsão) foram administradas por via intranasal em ratos Wistar e comparadas tendo em conta as concentrações cerebrais atingidas, tanto do pró-fármaco (sinvastatina) como da forma ativa (tenivastatina), em três tempos distintos (30, 120 e 360 minutos). Um segundo ensaio in vivo foi realizado de modo a obter resultados mais robustas das duas formulações anteriormente usadas, e também avaliar o papel da viscosidade e carga da nanoemulsão nas concentrações cerebrais de fármaco. As formulações foram também comparadas com uma solução de tenivastatina. Após diferentes estudos e processos de otimização, foi obtida uma nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% (m/m) que demonstrou enorme potencial nos estudos in vivo. Dependendo da concentração de fármaco encapsulada, 5.66% ou 7.41% (m/m) obteve-se uma nanoemulsão extremamente homogénea (PDI igual a 0.069 e 0.074, respetivamente), com pequenos tamanhos de gotícula (117.6 nm e 116.4 nm, respetivamente), após refrigeração da mesma (4 °C). A nanoemulsão apresentou caracter catiónico, com potenciais zeta de aproximadamente + 25 mV. Considerando a estabilidade física a curto prazo, a nanoemulsão com menor quantidade de fármaco obteve estabilidade por um período superior a 30 dias. Já a formulação com maior quantidade de fármaco, apenas obteve estabilidade por 3 dias. A nanoemulsão mostrou segurança considerando a dose de sinvastatina mais usada em modelos animais de acidente vascular isquémico (20 mg/Kg), bem como para a dose duas vezes superior (40 mg/Kg). A formulação mostrou ser fisicamente estável quando armazenada a 4 °C por um período de quatro meses. A estabilidade química da sinvastatina foi também prolongada quando a formulação foi armazenada a 4 °C. Quanto à osmolalidade, a formulação mostrou ser hiperosmótica, sendo mais segura face a soluções hiposmóticas. No entanto a formulação precisaria de uma diluição de 1.59 a 2.66 vezes de modo a obter valores de osmolalidade dentro do intervalo descrito como seguro para aplicação na cavidade nasal (300 a 700 mOsm/Kg). Durante os ensaios de libertação in vitro, verificou-se uma libertação incompleta, potencialmente devida a adsorção de sinvastatina, que poderá ter comprometido os resultados obtidos. É assim necessário avaliar otimizar este modelo in vitro para que melhor caracterizar o perfil de libertação da sinvastatina usando as diferentes formulações. Apesar disso os resultados poderão ser informativos, tendo a nanoemulsão obtido um perfil de libertação segundo o modelo de Higuchi. A 25 °C a nanoemulsão apresentou uma viscosidade de 24.62 mPa·s, que pode ser aumentada para 186.2 mPa·s utilizando PVP a 0.25% (m/m). Nos ensaios farmacocinéticos in vivo, a nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% originou as maiores concentrações cerebrais de sinvastatina após 30 minutos da administração por via intranasal, tanto no primeiro (153 ng/mL) como no segundo teste (131 ng/mL). Ambas as concentrações obtidas poderão ter o potencial de ser neuroprotetores embora, surpreendentemente, não se tenham detetado concentrações cerebrais de tenivastatina durante os ensaios in vivo. Concluindo, foi conseguida uma nanoemulsão com cloreto de cetalcónio a 0.5% (m/m) promissora para ser administrada pela via intranasal, de modo a explorar as propriedades neuroprotetoras da sinvastatina no acidente vascular isquémico. Existe ainda a necessidade de desenvolver estudos futuros que consigam correlacionar os resultados obtidos em ensaios farmacocinéticos e em ensaios funcionais usando modelos animais de acidente vascular cerebral isquémico já descritos na literatura, para melhor compreender o papel tanto da sinvastatina como da tenivastatin no acidente vascular isquémico e assim poder melhorar a sua cerebrovascular.
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Keywords
Intranasal Delivery Ischemic Stroke Microemulsions Nanoemulsions Simvastatin