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Abstract(s)
Globally, there are up to 10 million people diagnosed with Parkinson's Disease, a chronic neurodegenerative disorder without a cure. Physiologically, it is characterized by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Clinically, patients with this disease reveal several motor symptoms, such as tremors, tension, and postural instability, and non-motors, such as depression and anxiety. To date, the most effective drug combination used in the treatment of Parkinson's disease is the administration of levodopa (L-Dopa) combined with catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitors and monoamine oxidase inhibitors to restore dopaminergic brain levels. However, the commercially available inhibitors have low capabilities to cross the blood-brain barrier and, thus, low bioavailability in the brain. Also, the prolonged use of these drugs is associated with high hepatotoxicity, which currently limits their use. Therefore, the discovery of molecules with the potential to inhibit the COMT and the development of new delivery systems for these drugs are crucial elements to improve the effectiveness of existing therapies. Using polymeric nanoparticles as antiparkinsonian drug carriers presents numerous advantages considering the current therapies. These nanosystems can cross biological barriers due to their chemical properties and small size. Furthermore, they can achieve the therapeutic target more efficiently, increasing the bioavailability of the drug in restricted environments, such as the brain. Also, the application of polysaccharides in developing this type of delivery system presents advantages such as lower economic costs and better biocompatibility and biodegradability compared to oral and intravenous therapies. The discovery of the molecules 3,4-dihydroxy-5-nitrobenzonitrile (ZINC035) and 2- bromo-3,4-dihydroxy-S-nitrobenzaldehyde (ZINC496) as new COMT inhibitors, combined with the potential of nanoparticles based on natural polymers, such as gellan and chitosan, as drug delivery systems, have proven to be the impulse for this work. In the first part of this work, an analytical method using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) was developed to detect and quantify these new inhibitors in brain tissue samples from adult Wistar rats. In this study, the biological samples were spiked with each inhibitor and, subsequently, analyzed using two different types of detection, in which electrochemical detection (HPLC-ECD) was more effective for biological matrices than diode-array detection (HPLC-DAD). Additionally, a study was realized using different mobile phases, varying from 9 to 18% (v/v) of the organic compound (acetonitrile) to optimize the experimental procedure time. The results obtained using an HPLC-ECD analysis system interestingly showed that the molecules under study have interaction capabilities with brain tissues, and due to their similarity with commercial inhibitors, their potential use in Parkinson's therapies has been proven. In the progress of this work, a new polymeric delivery system has been developed to improve metabolism and absorption, increasing their chemical stability, decreasing their susceptibility to enzymatic degradation, and improving bioavailability of the commercial drugs. This delivery system results from the complexation of two natural polymers with opposite charges, the gellan gum (GG) and the chitosan (CH). These polymeric complexes were formulated, testing different conditions, varying the molecular weight of chitosan (5 kDa and low molecular weight) and the ratio and concentration of the polymers (0.05-1 mg/mL). After optimization, the GG/CH systems were prepared with the inclusion of the selected COMT inhibitor (ZINC035) or L-Dopa. In order to obtain the encapsulation efficiency of the nanoparticles, a purification system was developed, testing three different methodologies (centrifugation, filtration and molecular exclusion chromatography) and varying some conditions, such as centrifugation speeds (8000- 12500 rpm), the size of filter pore (0.22 and 0.45 µm) and the elution buffers (sodium acetate, sodium chloride and phosphate-buffered saline). The best GG/CH delivery system had a size of 238.52 nm; a polydispersity index (PDI) value of 0.449 and a zeta potential (ZP) of +30.2 mV. Also, GG/CH nanoparticles loaded with ZINC035 showed a mean size of 163.5 nm; a PDI of 0.355; a zeta potential of +20.6 mV and an encapsulation efficiency of 67.04%, which are stable up to 48h after formulation. Finally, the L-Dopa-loaded delivery systems achieved a size of 177.01 nm, a PDI of 0.392, and an encapsulation efficiency of approximately 26%. Overall, the HPLC system with electrochemical detection developed in this work is an effective and innovative methodology for studying COMT inhibitors in biological tissues. Furthermore, nanoparticulate polymeric systems have unique properties that can be used according to the desired intranasal delivery application and will certainly present advantages over conventional therapies.
Globalmente, existem cerca de 10 milhões de pessoas diagnosticadas com a Doença de Parkinson (DP), uma perturbação neurodegenerativa crónica sem cura. Fisiologicamente, a DP é caracterizada pela perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra. Clinicamente, estes doentes revelam vários sintomas motores, tais como tremores, tensão e instabilidade postural; bem como sintomas não motores como depressão e ansiedade. Atualmente, a combinação de fármacos mais eficaz utilizada no tratamento do alívio dos simtomas da DP é a administração de Levodopa (L-Dopa) combinada com inibidores da catecol-O-metil-transferase (COMT) e da monoamina oxidase, para repor os níveis dopaminérgicos cerebrais. No entanto, os inibidores comercialmente disponíveis têm baixa capacidade para atravessar a barreira hematoencefálica e, portanto, a sua biodisponibilidade no cérebro é reduzida. Paralelamente, o uso prolongado destes fármacos encontra-se associado a uma elevada hepatotoxicidade, o que limita atualmente a sua utilização. Desta forma, a descoberta de moléculas com potencial para inibir a enzima COMT, assim como o desenvolvimento de novos sistemas de entrega para esses fármacos, são elementos cruciais para melhorar a eficácia das terapias já existentes. A utilização de nanopartículas poliméricas como transportadores de fármacos antiparkinsonianos apresenta inúmeras vantagens face aos sistemas existentes. Estas possuem capacidade de transpor barreiras biológicas devido às suas propriedades químicas e ao seu tamanho reduzido. Para alem disso, conseguem atingir o seu alvo terapêutico com maior facilidade, aumentando a biodisponibilidade do fármaco em ambientes restritos como o do cérebro. Por outro lado, a aplicação de polissacarídeos no desenvolvimento deste tipo de sistemas de entrega apresenta menores custos, maior biocompatibilidade e biodegradabilidade face às terapias atualmente utilizadas. O registo das moléculas 3,4-dihydroxy-5-nitrobenzonitrile (ZINC035) e 2-bromo-3,4- dihydroxy-S-nitrobenzaldehyde (ZINC496) como novos inibidores eficazes da enzima COMT, aliado à potencialidade de polímeros como a gelana e o quitosano para o desenvolvimento de nanossistemas de entrega, revelou-se o mote para o desenvolvimento deste trabalho. Assim, utilizando Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) foi desenvolvido um método analítico para a deteção e quantificação destes novos inibidores em amostras de tecidos cerebrais provenientes de ratos Wistar adultos. Neste estudo, as amostras biológicas forma fortificadas com os inibidores e posteriormente analisadas recorrendo a dois tipos de deteção diferentes, das quais a deteção eletroquímica (HPLC-ECD) se mostrou mais eficaz para matrizes biológicas face à deteção Diode-Array (HPLC-DAD). Adicionalmente, de forma a otimizar o tempo de procedimento experimental, o estudo contou com a utilização de distintas fases móveis, variando a quantidade de fase orgânica (9-18 % v/v de acetonitrilo). Os resultados obtidos mostraram que as moléculas em estudo têm capacidades de interação com tecidos cerebrais semelhantes aos inibidores atualmente comercializados, comprovando a sua potencialidade de utilização em terapias para o Parkinson. No progresso deste trabalho, foram desenvolvidos sistemas de entrega (nanopartículas), por forma a resolver alguns dos problemas associados aos medicamentos comerciais. As nanopartículas resultam da complexação de dois polímeros naturais com cargas opostas, a gelana (GG) e o quitosano (CH), com o objetivo de melhorar o metabolismo e absorção, aumentar a sua estabilidade química, diminuir a sua suscetibilidade à degradação enzimática e melhorar a biodisponibilidade da L-Dopa e um inibidor da COMT. Estes complexos poliméricos foram formulados e caracterizados, testando-se diversas condições, nomeadamente variando o peso molecular do quitosano (5 kDa e baixo peso molecular) e a proporção e concentração dos polímeros (0.05-1 mg/mL). Seguidamente, os sistemas de GG/CH foram preparados com a inclusão do inibidor da COMT selecionado (ZINC035) ou da L-Dopa. Para a obtenção da eficiência de encapsulação das NPs, foi ainda otimizado um sistema de purificação, recorrendo a diferentes metodologias (centrifugação, filtração e separação por cromatografia de exclusão molecular) e condições utilizadas nessas metodologias: velocidades de centrifugação (8000-12500 rpm), tamanho de poro de filtro (0.22 e 0.45 µm) e tampões de eluição com diferentes pH (acetato de sódio, salino e fosfato de sódio). Dos resultados principais destacam-se: os melhores sistemas de entrega vazios apresentaram um tamanho de 238,52 nm; 0,449 de índice de polidispersidade (PDI) e um potencial zeta (ZP) de +30,2 mV. Os sistemas de entrega que encapsularam o ZINC035 mostraram um tamanho de 163,5 nm; um PDI de 0,355; um potencial zeta de +20,6mV e uma eficiência de encapsulamento de 67,04%, sendo estes estáveis até 48h após a sua formulação. Finalmente, os sistemas de entrega carregados com L-Dopa obtiveram um tamanho de 177,01 nm, um PDI de 0,392 e uma eficiência de encapsulamento de aproximadamente 26%. No geral, o sistema de HPLC com deteção eletroquímica desenvolvido neste trabalho, assume-se como uma eficaz e inovadora metodologia para o estudo de inibidores da COMT em tecidos biológicos. Para além disso, os sistemas poliméricos nanoparticulados possuem propriedades singulares que podem ser empregues de acordo com a aplicação de entrega intranasal desejada, e que certamente apresentarão vantagens face às terapias convencionais utilizadas.
Globalmente, existem cerca de 10 milhões de pessoas diagnosticadas com a Doença de Parkinson (DP), uma perturbação neurodegenerativa crónica sem cura. Fisiologicamente, a DP é caracterizada pela perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra. Clinicamente, estes doentes revelam vários sintomas motores, tais como tremores, tensão e instabilidade postural; bem como sintomas não motores como depressão e ansiedade. Atualmente, a combinação de fármacos mais eficaz utilizada no tratamento do alívio dos simtomas da DP é a administração de Levodopa (L-Dopa) combinada com inibidores da catecol-O-metil-transferase (COMT) e da monoamina oxidase, para repor os níveis dopaminérgicos cerebrais. No entanto, os inibidores comercialmente disponíveis têm baixa capacidade para atravessar a barreira hematoencefálica e, portanto, a sua biodisponibilidade no cérebro é reduzida. Paralelamente, o uso prolongado destes fármacos encontra-se associado a uma elevada hepatotoxicidade, o que limita atualmente a sua utilização. Desta forma, a descoberta de moléculas com potencial para inibir a enzima COMT, assim como o desenvolvimento de novos sistemas de entrega para esses fármacos, são elementos cruciais para melhorar a eficácia das terapias já existentes. A utilização de nanopartículas poliméricas como transportadores de fármacos antiparkinsonianos apresenta inúmeras vantagens face aos sistemas existentes. Estas possuem capacidade de transpor barreiras biológicas devido às suas propriedades químicas e ao seu tamanho reduzido. Para alem disso, conseguem atingir o seu alvo terapêutico com maior facilidade, aumentando a biodisponibilidade do fármaco em ambientes restritos como o do cérebro. Por outro lado, a aplicação de polissacarídeos no desenvolvimento deste tipo de sistemas de entrega apresenta menores custos, maior biocompatibilidade e biodegradabilidade face às terapias atualmente utilizadas. O registo das moléculas 3,4-dihydroxy-5-nitrobenzonitrile (ZINC035) e 2-bromo-3,4- dihydroxy-S-nitrobenzaldehyde (ZINC496) como novos inibidores eficazes da enzima COMT, aliado à potencialidade de polímeros como a gelana e o quitosano para o desenvolvimento de nanossistemas de entrega, revelou-se o mote para o desenvolvimento deste trabalho. Assim, utilizando Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) foi desenvolvido um método analítico para a deteção e quantificação destes novos inibidores em amostras de tecidos cerebrais provenientes de ratos Wistar adultos. Neste estudo, as amostras biológicas forma fortificadas com os inibidores e posteriormente analisadas recorrendo a dois tipos de deteção diferentes, das quais a deteção eletroquímica (HPLC-ECD) se mostrou mais eficaz para matrizes biológicas face à deteção Diode-Array (HPLC-DAD). Adicionalmente, de forma a otimizar o tempo de procedimento experimental, o estudo contou com a utilização de distintas fases móveis, variando a quantidade de fase orgânica (9-18 % v/v de acetonitrilo). Os resultados obtidos mostraram que as moléculas em estudo têm capacidades de interação com tecidos cerebrais semelhantes aos inibidores atualmente comercializados, comprovando a sua potencialidade de utilização em terapias para o Parkinson. No progresso deste trabalho, foram desenvolvidos sistemas de entrega (nanopartículas), por forma a resolver alguns dos problemas associados aos medicamentos comerciais. As nanopartículas resultam da complexação de dois polímeros naturais com cargas opostas, a gelana (GG) e o quitosano (CH), com o objetivo de melhorar o metabolismo e absorção, aumentar a sua estabilidade química, diminuir a sua suscetibilidade à degradação enzimática e melhorar a biodisponibilidade da L-Dopa e um inibidor da COMT. Estes complexos poliméricos foram formulados e caracterizados, testando-se diversas condições, nomeadamente variando o peso molecular do quitosano (5 kDa e baixo peso molecular) e a proporção e concentração dos polímeros (0.05-1 mg/mL). Seguidamente, os sistemas de GG/CH foram preparados com a inclusão do inibidor da COMT selecionado (ZINC035) ou da L-Dopa. Para a obtenção da eficiência de encapsulação das NPs, foi ainda otimizado um sistema de purificação, recorrendo a diferentes metodologias (centrifugação, filtração e separação por cromatografia de exclusão molecular) e condições utilizadas nessas metodologias: velocidades de centrifugação (8000-12500 rpm), tamanho de poro de filtro (0.22 e 0.45 µm) e tampões de eluição com diferentes pH (acetato de sódio, salino e fosfato de sódio). Dos resultados principais destacam-se: os melhores sistemas de entrega vazios apresentaram um tamanho de 238,52 nm; 0,449 de índice de polidispersidade (PDI) e um potencial zeta (ZP) de +30,2 mV. Os sistemas de entrega que encapsularam o ZINC035 mostraram um tamanho de 163,5 nm; um PDI de 0,355; um potencial zeta de +20,6mV e uma eficiência de encapsulamento de 67,04%, sendo estes estáveis até 48h após a sua formulação. Finalmente, os sistemas de entrega carregados com L-Dopa obtiveram um tamanho de 177,01 nm, um PDI de 0,392 e uma eficiência de encapsulamento de aproximadamente 26%. No geral, o sistema de HPLC com deteção eletroquímica desenvolvido neste trabalho, assume-se como uma eficaz e inovadora metodologia para o estudo de inibidores da COMT em tecidos biológicos. Para além disso, os sistemas poliméricos nanoparticulados possuem propriedades singulares que podem ser empregues de acordo com a aplicação de entrega intranasal desejada, e que certamente apresentarão vantagens face às terapias convencionais utilizadas.
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Keywords
Doença de Parkinson Inibidores da COMT HPLC Sistema de Entrega Gelana Parkinson’s Disease