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Authors
Abstract(s)
The choroid plexuses (CPs) are composed of a single layer of cuboid epithelial cells laying on highly irrigated connective tissue. In addition to being the main producer of cerebrospinal fluid (CSF) in the central nervous system, the CPs are also responsible for the production and secretion of peptides that modulate brain function. CP-derived peptides have been associated with several physiological functions, including inflammation and immune response, signaling, cell growth and cell proliferation, cell death, metabolism, and angiogenesis, among others. Proteins present in the CP secretome have been implicated in the modulation of neurogenesis during developmental stages and adult life. The identification of new neurogenic factors is highly relevant considering the increasing ageing of the population and the incidence of neurodegenerative disorders.
Preliminary data from a rat CP microarrays study from our research group suggested local expression of several factors with the potential to promote neurogenesis that had never been associated with the CP before. One of the most relevant transcripts identified was prolactin. Amongst the numerous distinct biological functions attributed to prolactin, this hormone has been described as a neurogenic factor at specific stages of pregnancy and lactation in rodents. In addition, the presence of prolactin transcripts was higher in CPs collected from female rats than male rats, suggesting that sex hormones could modulate prolactin expression in the CP.
The first aim of this thesis was to investigate if the rat CP could indeed be an alternative source of prolactin to the brain. In Chapter 4 we provide evidence that prolactin transcripts were present in pregnant rat CP, CP epithelial cells (CPEC) and in the rat immortalized CP cell line, Z310. Furthermore, a 63 kDa immunoreactive PRL was detected by Western blot in CP protein extracts as well as in culture medium supernatants after the incubation with rat pituitary and samples of rat cerebrospinal fluid and serum. Moreover, prolactin immunoreactive protein was present in both compartments of the blood-CSF barrier model which may indicate that CPEC can secrete prolactin not only through the apical membrane facing the CSF but also through the basal membrane facing the blood.
To ascertain the possible influence of sex hormones in the production of prolactin in the rat CP as initially hypothesized, we performed 24-hour incubations of CP explants with different concentrations of estradiol, progesterone, or dihydrotestosterone. Nonetheless, neither of the hormones seem to modulate the levels of 63 kDa prolactin in the CP tissues, at least at the concentrations tested in this work, as described in Chapter 5.
Besides being a source of prolactin, the CP is the brain structure with the higher expression of prolactin receptors (PRLR). The high expression of PRLR at the CP was initially associated with the existence of a receptor-mediated mechanism responsible for prolactin transport to the brain present. Nevertheless, considering recent evidence, it is now accepted that prolactin uptake is independent of its receptors. Information about the exact function of prolactin in the CP is still very scarce, especially in the postnatal stages. As so, another main goal of this thesis was to evaluate the effects of prolactin in the transcriptome of postnatal rat CP. In Chapter 6 we observed that prolactin exposure was associated with a reduction in neurogenesis-factor osteopontin, barrier protein claudin 5, and proliferation-related cyclin D1. On the other hand, prolactin incubation also led to an increase in pro-inflammatory interleukin 1 beta expression, suggesting that at a postnatal stage, prolactin exposure may increase the CP permeability, reduce the cellular proliferation and have a proinflammatory effect on the rat CP.
Another goal of this thesis was to identify additional neurogenic factors secreted by the CP. In Chapter 7 we provide evidence that the rat CP may be a source of secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2), previously described as a regulator of neural stem cells proliferation, differentiation and homeostasis. Notably, estradiol seems to modulate the levels of SFRP2 in the rat CP.
In summary, the evidence reported throughout this work supports the relevance of the CP as a source of new peptides with the potential to modulate brain function, like prolactin and SFRP2. Further studies are necessary to understand the relevance of CP-derived prolactin and SFRP2 in brain function, especially in neurogenesis.
Os plexos coróides (CPs), localizados em cada um dos ventrículos cerebrais, são constituídos por uma camada de células epiteliais cubóides situadas sobre tecido conjuntivo altamente irrigado. Para além de serem os principais produtores de líquido cefalorraquidiano (CSF) no sistema nervoso central, os CPs são também responsáveis pela produção e secreção de péptidos com a capacidade de modular a função do cérebro. Os péptidos com origem no CP foram associados a diversas funções fisiológicas, incluindo inflamação e resposta imunológica, sinalização, proliferação e crescimento celular, morte celular, metabolismo e angiogénese, entre outras. As proteínas que constituem o secretoma do CP têm sido implicadas na modulação da neurogénese durante as fases de desenvolvimento bem como na idade adulta. A identificação de fatores com potencial neurogénico é extremamente relevante considerando o crescente envelhecimento populacional verificado a nível mundial e a alta incidência de doenças neurodegenerativas. Dados preliminares de um estudo de microarrays com amostras de CP de rato, previamente realizado pelo nosso grupo de trabalho, sugerem a ocorrência da expressão de diversos fatores com potencial para promover a neurogénese, que não tinham sido anteriormente associados a esta estrutura do cérebro. Um dos transcritos mais relevantes, identificados neste estudo foi a prolactina. A prolactina é uma hormona polipeptídica sintetizada e secretada maioritariamente por células especializadas da glândula pituitária (ou hipófise). Para além das relacionadas com a reprodução nos mamíferos, esta hormona pleiotrópica está associada a centenas de funções biológicas distintas. As evidências científicas sugerem que a prolactina desempenha um papel como indutora da neurogénese em fases específicas da gestação e da amamentação em roedores. Para além disso, no nosso estudo prévio de microarrays foi também observado que a presença de transcritos de prolactina era mais elevada nos CPs recolhidos de fêmeas que nos CPs de machos, sugerindo que as hormonas sexuais podem desempenhar um papel relevante na modulação da expressão de prolactina no CP. Com base na informação descrita anteriormente, um dos objetivos desta tese foi investigar se o CP é de facto uma fonte alternativa de prolactina no cérebro de rato. No Capítulo 4 apresentamos evidências de que os transcritos de prolactina estão presentes em CPs recolhidos de fêmeas gestantes, em células epiteliais de CP (CPEC) de rato e em células da linha celular Z310 (linha celular de células epiteliais de CP de rato). Adicionalmente, foi ainda detetada, por Western blot, a presença de uma proteína imunorreativa, a prolactina com 63 kDa, em extratos proteicos de CP de rato, de extratos proteicos de CPEC e de células Z310, assim como em sobrenadantes de meio de cultura previamente incubado com pituitárias de rato e amostras de soro e de CSF de ratos. A utilização de um modelo in vitro da barreira sangue-CSF, com culturas primárias de CPEC de rato em insertos de placas de cultura, permitiu observar a presença da mesma proteína imunorreativa à prolactina tanto no compartimento superior (CSF) como no compartimento inferior (sangue) do referido modelo de cultura. Estes dados parecem indicar que as CPEC são capazes de secretar prolactina não só pelo lado apical das células, que se encontra em contacto com o CSF, mas também pelo lado basal das células em contacto com o sangue. Paralelamente, e utilizando o mesmo modelo in vitro, foi ainda possível observar por imunocitoquímica, que os recetores de prolactina (PRLR) se encontram distribuídos tanto no citoplasma como nas membranas basal e apical das CPEC. Avaliámos também a possível influência das hormonas sexuais na produção de prolactina no CP de rato num modelo experimental de CP ex vivo. Para isso, explantes de CPs foram incubados durante 24 horas com diferentes concentrações de estradiol, progesterona e dihidrotestosterona, como descrito no Capítulo 5. Como esperado, a incubação com estradiol promoveu o aumento da secreção de prolactina nos explantes de pituitária, que serviram como controlos positivos da experiência. No entanto, nem a progesterona nem a dihidrotestosterona influenciaram a produção e a secreção da prolactina no tecido pituitário. Em relação ao CP, e contrariamente ao que tinha sido observado no estudo de microarrays, nenhuma das hormonas teve influência nos níveis de prolactina no CP, pelo menos nas concentrações testadas neste trabalho. Por outro lado, além de ser uma fonte alternativa de prolactina, o CP é a estrutura do cérebro que expressa PRLR em maior quantidade. Inicialmente, a elevada expressão de PRLR no CP foi associada à existência de um mecanismo de transporte de prolactina para o cérebro mediado pelos PRLR presentes no CP. Contudo, os dados reportados recentemente, obtidos com um modelo de ablação de PRLR no CP de murganhos, mostraram que o transporte de prolactina para o cérebro não é mediado pelos PRLR. O mecanismo exato de transporte de prolactina para o sistema nervoso central é ainda desconhecido, embora o transporte a nível da microvasculatura seja apontado como a provável via de entrada para o cérebro. Por estes motivos, a informação relativa ao papel da prolactina e dos seus recetores no CP é atualmente escassa, especialmente em fases pós-natais. Consequentemente, outro dos objetivos principais desta tese consistiu na avaliação do efeito da exposição de prolactina no transcriptoma do CP de ratos pós-natais. Como descrito ao longo do Capítulo 6, a incubação de explantes de CPs recolhidos de ratos recém-nascidos foi associada a uma diminuição da expressão de osteopontina (Spp1), uma proteína previamente implicada na indução de neurogénese mediada pelo CP. Adicionalmente, a exposição a prolactina reduziu a expressão de genes associados a proteínas de barreira, nomeadamente da claudina 5 (Cldn5), bem como de proteínas de proliferação celular, como a ciclina D1 (Ccdn1). Para além disso, a exposição à prolactina levou ao aumento da expressão de citocina pró-inflamatória interleucina 1 beta. Em suma estes dados parecem sugerir que a exposição à prolactina durante a fase pós-natal parece aumentar a permeabilidade do CP, reduzir a proliferação celular e ter um efeito pro-inflamatório no CP de rato. Por último, este trabalho teve como objetivo identificar a existência de outros fatores com potencial neurogénico com origem no CP de rato. No Capítulo 7, são apresentadas evidências de que o CP de rato pode ser uma fonte alternativa de proteína secretada relacionada ao recetor frizzled 2 (SFRP2). Como consequência da semelhança com o domínio extracelular dos recetores frizzled, a SFRP2 compete com estes recetores pela ligação a fatores solúveis Wnt, interferindo com esta via de sinalização. A nível do funcionamento do cérebro, esta proteína foi precedentemente associada à modulação da proliferação, diferenciação e migração de células estaminais e progenitoras, assim como à regulação da densidade de espículas dendríticas, sendo também implicada na patologia de algumas doenças neurodegenerativas. Para além disso, os resultados descritos no Capítulo 7 parecem indicar que o estradiol é um dos reguladores dos níveis de SFRP2 no CP. Apesar da exposição ao estradiol aumentar os níveis de SFRP2 no CP, este aumento não é acompanhado por um aumento da secreção desta proteína. Em resumo, as evidências reportadas ao longo deste trabalho reforçam a relevância do CP como produtor e secretor de péptidos com capacidade de modular a função do cérebro. Neste caso em particular, são apresentados resultados que suportam que o CP é uma fonte alternativa tanto de prolactina como de SFRP2 no cérebro. São necessários estudos adicionais para investigar as funções biológicas da prolactina e do SFRP2 produzidos pelo CP e avaliar se os mesmos têm alguma influência na modulação de neurogénese nos nichos neurogénicos adjacentes. Adicionalmente, será ainda necessário realizar estudos com o objetivo de identificar e investigar possíveis fatores com capacidade de regular a síntese, produção e secreção de prolactina e SFRP2 no CP de rato. Face ao crescente envelhecimento da população e ao aumento da incidência e da prevalência de doenças neurodegenerativas, a modulação da produção e secreção de fatores com potencial de indução de neurogénese com origem no CP pode ser considerada como uma possível abordagem terapêutica. Nesse sentido, os resultados apresentados nesta tese podem servir como base de futuras investigações conducentes à identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de doenças neurodegenerativas.
Os plexos coróides (CPs), localizados em cada um dos ventrículos cerebrais, são constituídos por uma camada de células epiteliais cubóides situadas sobre tecido conjuntivo altamente irrigado. Para além de serem os principais produtores de líquido cefalorraquidiano (CSF) no sistema nervoso central, os CPs são também responsáveis pela produção e secreção de péptidos com a capacidade de modular a função do cérebro. Os péptidos com origem no CP foram associados a diversas funções fisiológicas, incluindo inflamação e resposta imunológica, sinalização, proliferação e crescimento celular, morte celular, metabolismo e angiogénese, entre outras. As proteínas que constituem o secretoma do CP têm sido implicadas na modulação da neurogénese durante as fases de desenvolvimento bem como na idade adulta. A identificação de fatores com potencial neurogénico é extremamente relevante considerando o crescente envelhecimento populacional verificado a nível mundial e a alta incidência de doenças neurodegenerativas. Dados preliminares de um estudo de microarrays com amostras de CP de rato, previamente realizado pelo nosso grupo de trabalho, sugerem a ocorrência da expressão de diversos fatores com potencial para promover a neurogénese, que não tinham sido anteriormente associados a esta estrutura do cérebro. Um dos transcritos mais relevantes, identificados neste estudo foi a prolactina. A prolactina é uma hormona polipeptídica sintetizada e secretada maioritariamente por células especializadas da glândula pituitária (ou hipófise). Para além das relacionadas com a reprodução nos mamíferos, esta hormona pleiotrópica está associada a centenas de funções biológicas distintas. As evidências científicas sugerem que a prolactina desempenha um papel como indutora da neurogénese em fases específicas da gestação e da amamentação em roedores. Para além disso, no nosso estudo prévio de microarrays foi também observado que a presença de transcritos de prolactina era mais elevada nos CPs recolhidos de fêmeas que nos CPs de machos, sugerindo que as hormonas sexuais podem desempenhar um papel relevante na modulação da expressão de prolactina no CP. Com base na informação descrita anteriormente, um dos objetivos desta tese foi investigar se o CP é de facto uma fonte alternativa de prolactina no cérebro de rato. No Capítulo 4 apresentamos evidências de que os transcritos de prolactina estão presentes em CPs recolhidos de fêmeas gestantes, em células epiteliais de CP (CPEC) de rato e em células da linha celular Z310 (linha celular de células epiteliais de CP de rato). Adicionalmente, foi ainda detetada, por Western blot, a presença de uma proteína imunorreativa, a prolactina com 63 kDa, em extratos proteicos de CP de rato, de extratos proteicos de CPEC e de células Z310, assim como em sobrenadantes de meio de cultura previamente incubado com pituitárias de rato e amostras de soro e de CSF de ratos. A utilização de um modelo in vitro da barreira sangue-CSF, com culturas primárias de CPEC de rato em insertos de placas de cultura, permitiu observar a presença da mesma proteína imunorreativa à prolactina tanto no compartimento superior (CSF) como no compartimento inferior (sangue) do referido modelo de cultura. Estes dados parecem indicar que as CPEC são capazes de secretar prolactina não só pelo lado apical das células, que se encontra em contacto com o CSF, mas também pelo lado basal das células em contacto com o sangue. Paralelamente, e utilizando o mesmo modelo in vitro, foi ainda possível observar por imunocitoquímica, que os recetores de prolactina (PRLR) se encontram distribuídos tanto no citoplasma como nas membranas basal e apical das CPEC. Avaliámos também a possível influência das hormonas sexuais na produção de prolactina no CP de rato num modelo experimental de CP ex vivo. Para isso, explantes de CPs foram incubados durante 24 horas com diferentes concentrações de estradiol, progesterona e dihidrotestosterona, como descrito no Capítulo 5. Como esperado, a incubação com estradiol promoveu o aumento da secreção de prolactina nos explantes de pituitária, que serviram como controlos positivos da experiência. No entanto, nem a progesterona nem a dihidrotestosterona influenciaram a produção e a secreção da prolactina no tecido pituitário. Em relação ao CP, e contrariamente ao que tinha sido observado no estudo de microarrays, nenhuma das hormonas teve influência nos níveis de prolactina no CP, pelo menos nas concentrações testadas neste trabalho. Por outro lado, além de ser uma fonte alternativa de prolactina, o CP é a estrutura do cérebro que expressa PRLR em maior quantidade. Inicialmente, a elevada expressão de PRLR no CP foi associada à existência de um mecanismo de transporte de prolactina para o cérebro mediado pelos PRLR presentes no CP. Contudo, os dados reportados recentemente, obtidos com um modelo de ablação de PRLR no CP de murganhos, mostraram que o transporte de prolactina para o cérebro não é mediado pelos PRLR. O mecanismo exato de transporte de prolactina para o sistema nervoso central é ainda desconhecido, embora o transporte a nível da microvasculatura seja apontado como a provável via de entrada para o cérebro. Por estes motivos, a informação relativa ao papel da prolactina e dos seus recetores no CP é atualmente escassa, especialmente em fases pós-natais. Consequentemente, outro dos objetivos principais desta tese consistiu na avaliação do efeito da exposição de prolactina no transcriptoma do CP de ratos pós-natais. Como descrito ao longo do Capítulo 6, a incubação de explantes de CPs recolhidos de ratos recém-nascidos foi associada a uma diminuição da expressão de osteopontina (Spp1), uma proteína previamente implicada na indução de neurogénese mediada pelo CP. Adicionalmente, a exposição a prolactina reduziu a expressão de genes associados a proteínas de barreira, nomeadamente da claudina 5 (Cldn5), bem como de proteínas de proliferação celular, como a ciclina D1 (Ccdn1). Para além disso, a exposição à prolactina levou ao aumento da expressão de citocina pró-inflamatória interleucina 1 beta. Em suma estes dados parecem sugerir que a exposição à prolactina durante a fase pós-natal parece aumentar a permeabilidade do CP, reduzir a proliferação celular e ter um efeito pro-inflamatório no CP de rato. Por último, este trabalho teve como objetivo identificar a existência de outros fatores com potencial neurogénico com origem no CP de rato. No Capítulo 7, são apresentadas evidências de que o CP de rato pode ser uma fonte alternativa de proteína secretada relacionada ao recetor frizzled 2 (SFRP2). Como consequência da semelhança com o domínio extracelular dos recetores frizzled, a SFRP2 compete com estes recetores pela ligação a fatores solúveis Wnt, interferindo com esta via de sinalização. A nível do funcionamento do cérebro, esta proteína foi precedentemente associada à modulação da proliferação, diferenciação e migração de células estaminais e progenitoras, assim como à regulação da densidade de espículas dendríticas, sendo também implicada na patologia de algumas doenças neurodegenerativas. Para além disso, os resultados descritos no Capítulo 7 parecem indicar que o estradiol é um dos reguladores dos níveis de SFRP2 no CP. Apesar da exposição ao estradiol aumentar os níveis de SFRP2 no CP, este aumento não é acompanhado por um aumento da secreção desta proteína. Em resumo, as evidências reportadas ao longo deste trabalho reforçam a relevância do CP como produtor e secretor de péptidos com capacidade de modular a função do cérebro. Neste caso em particular, são apresentados resultados que suportam que o CP é uma fonte alternativa tanto de prolactina como de SFRP2 no cérebro. São necessários estudos adicionais para investigar as funções biológicas da prolactina e do SFRP2 produzidos pelo CP e avaliar se os mesmos têm alguma influência na modulação de neurogénese nos nichos neurogénicos adjacentes. Adicionalmente, será ainda necessário realizar estudos com o objetivo de identificar e investigar possíveis fatores com capacidade de regular a síntese, produção e secreção de prolactina e SFRP2 no CP de rato. Face ao crescente envelhecimento da população e ao aumento da incidência e da prevalência de doenças neurodegenerativas, a modulação da produção e secreção de fatores com potencial de indução de neurogénese com origem no CP pode ser considerada como uma possível abordagem terapêutica. Nesse sentido, os resultados apresentados nesta tese podem servir como base de futuras investigações conducentes à identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de doenças neurodegenerativas.
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