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Authors
Abstract(s)
Every day, an extensive and varied range of emerging contaminants encounter
humans. Exposure to these endocrine-disrupting chemicals (EDCs) is not without risks
and has even been associated with adverse effects on multiple human systems, including
the cardiovascular system. Due to the fundamental role of thyroid hormones (TH) in
vascular homeostasis, EDCs capable of disturbing thyroid homeostasis (thyroid disruptive
chemicals, TDCs) may increase the risk of cardiovascular disease (CVD). However, the
mechanisms underlying thyroid disruption associated with the progression or
development of CVD are not fully understood. Endocrine disruption is one of the biggest
concerns and, therefore, one of the most extensive research forces. Endocrine disruption
comprises a diverse set of target organs, processes, and modes of action (MoA), with
multiple interactions and complex actions. Periods of development, such as pregnancy, are
susceptible to endocrine disruption and constitute a priority area of research.
Pregnant women often use various personal care products containing UV filters.
The UV-B filters are designed to protect humans against the biological effects of UV
radiation. However, their use has been questioned, and some concerns of toxicity to
human health have emerged, demonstrating an EDC role for some UV filters.
Octylmethoxycinnamate (OMC) is one of the most used UV-B filters worldwide.
However, the OMC is also an EDC that affects human health and the environment, and its
use remains under intense controversy. The scientific community has given special
importance to the environmental and severe effects on coral reefs and aquatic species,
which led to OMC being withdrawn from the market in different countries since 2018. On
the contrary, the endocrine-disrupting effects in humans have been neglected despite in
vitro studies having proven effects at the estrogenic level and non-consensual effects
concerning (anti)thyroid and (anti)androgenic activities. Based on the above, it is
worrying that the effects of a UV filter widely used worldwide are practically unknown on
human health.
Within the scope of my MSc dissertation, we demonstrated that OMC acts as a
rapid vasodilator of the human umbilical artery (HUA). Although this vasorelaxation has a
short-term beneficial effect on the vascular system, also observed with other EDCs, in the
long term, all EDCs studied impaired the main vasorelaxation mechanisms of HUA
through different MoA. In the case of OMC, only one study evaluated its short-term effects on human vasculature, and the effects of its long-term exposure on human health were not
known until this research.
Therefore, the main objective of this doctoral thesis was to understand whether
exposure to the OMC UV filter impairs human vascular function in the presence of thyroid
disorders. We hypothesize that exposure to OMC has adverse effects on the human
vasculature, altering the expression of different receptors involved in thyroid functions. To
achieve our objective and answer our research hypothesis, various in silico (molecular
docking), ex vivo, in vitro (HUA and human umbilical artery smooth muscle cells,
HUASMC), and in vivo (zebrafish) approaches were outlined.
The first research work analysed the effects of long-term exposure to OMC on HUA
vascular homeostasis. Potential changes in the vascular responses of proteins and
channels involved in contractile processes were the focus of the research. The effects of 24-
hour exposure to OMC (1, 10, and 50 μmol/L) were evaluated on HUA contractile
responses to serotonin (5-HT) and potassium chloride (KCl). The data showed that
exposure to OMC altered HUA vascular homeostasis; therefore, its MoA was explored in
more detail by studying the activity of cyclic guanosine 3’,5’–monophosphate (cGMP) and
Ca2+ channels (two pathways involved in its relaxation and contraction, respectively).
Prolonged exposure to OMC impaired the main vasorelaxant mechanism of HUA.
Interference in the nitric oxide (NO)/soluble guanyl cyclase (sGC)/cGMP/protein kinase G
(PKG) signaling pathway and modulation of L-Type voltage-operated Ca2+ channels,
BKCa1.1 potassium channels (α subunit), and PKG were the MoA implicated in the
decrease in the contractile response. This work demonstrated that OMC could
compromise vascular homeostasis in pregnant women and may have a role in the
induction of hypertensive diseases of pregnancy.
The HUA is regulated mainly by local mediators (5-HT and histamine, His).
Membrane receptors, such as G protein-coupled receptors, GPCR induce the effects of
these mediators which, when altered, compromises maternal-foetal health. Elevated levels
of 5-HT and His increased HUA reactivity/sensitivity to these vasoactive agents,
increasing vascular resistance and inducing preeclampsia (PE) and gestational
hypertension. On the other hand, it has been demonstrated that EDCs can activate
membrane receptors and alter signal transduction. Based on the above and considering
the results obtained in the first study, our second research work deepened knowledge
about the effects of prolonged exposure to OMC on vascular homeostasis, evaluating the
modulation of receptors involved in the contractile processes of HUA. In this work, the
research focused on the activity and expression of different 5-HT and His receptors. Thus, the effects of 24-hour exposure to OMC (1, 10 and 50 μmol/L) were evaluated on the
contractile responses of HUA to 5-HT and His, using different specific agonists and
antagonists, namely 5-HT2A receptor agonist (AMHT), 5-HT7 receptor agonist (AS19), 5-
HT1B/1D receptor agonist (L69), H1 receptor agonist (BHI), H2 receptor agonist (dimaprit)
and H2 receptor antagonist (cimetidine). Our results demonstrated that exposure to OMC
increased HUA reactivity to the vasoactive agents under study. Consequently, and in line
with previous research, our results denote a potential role for OMC in the development of
hypertensive diseases of pregnancy, such as PE or gestational hypertension.
In the third research work, the effects of short- and long-term exposure to OMC
were evaluated on the vasculature of pregnant women with hypothyroidism. Although it
has been suggested that OMC is a TDC due to its action on thyroid hormone receptor (TR),
its disruptive effects on thyroid pathologies during pregnancy have never been evaluated.
Therefore, in this study, we assessed the disruptive vascular effects of OMC in
hypothyroidism conditions. Computational simulations using molecular docking allowed
the correlation of vascular changes with the action of OMC on TRα. Our results indicated
that OMC alters the contractility patterns of HUA contracted with 5-HT, His, and KCl,
possibly due to interference with 5-HT and His receptors and/or involvement of Ca2+
channels (as shown in two previous investigations, in the absence of thyroid pathologies).
Molecular docking analysis confirmed OMC competition with the endogenous hormone
T3 for binding to the active centre of TRα, supporting the observed vascular changes.
Taken together, our data demonstrate that exposure to OMC alters the vascular reactivity
of pregnant women with thyroid pathologies and, thus, may be related to an increased risk
and development of cardiovascular diseases.
In the fourth research work, developing zebrafish embryos were used as a model to
study the effects of OMC exposure in conditions of thyroid pathologies. This work aimed
to unravel whether and how the response to OMC exposure is altered by developmental
hypothyroidism and hyperthyroidism simulated conditions in zebrafish developing
embryos and impair their normal development. For this purpose, developmental
hypothyroidism and hyperthyroidism were induced through exogenous exposure to PTU
(propylthiouracil, an anti-thyroid drug) or T3 (triiodothyronine endogenous hormone),
respectively. Then, embryos were exposed during 120h to OMC isolated and in binary
mixture with PTU or T3. In hypo- or hyperthyroidism developmental conditions, exposure
to OMC impaired the embryonic development of zebrafish through the induction of
several malformations. Pericardial and yolk sac oedema, yolk sac delayed absorption, noninflation
of the swim bladder, notochord curvature, and lack of pigmentation were the
most prevalent malformations. Furthermore, exposure to OMC under these conditions impairs the behaviour of larvae. Altered transcription of genes related with the HPT axis
found proves the TDC action of the OMC. Our findings highlight a modified OMC
response in the presence of thyroid pathologies, with harmful effects in development
period more sensitive to endocrine disruption, which is in line with research work III.
Lastly, the fifth research work was based on the study of the molecular interactions
of the OMC in the HPT axis and their implications for humans and zebrafish. This in silico
research aimed to reveal the different modes of interaction of the OMC at different levels
of the HPT axis, comparing it to the PTU and T3. Our results demonstrated an action of
OMC at different levels on the HPT axis, with different actions depending on the target.
Molecular docking analysis revealed favourable binding to the corticotrophin-releasing
hormone (CRH) receptor and the TH transporter protein, transthyretin (TTR).
Furthermore, competition with T3 (inverse agonist activity) was observed for TRα and
TRβ. Overall, the action of OMC appears to lead to a decrease in TH, which may promote
hypothyroidism. This investigation proves that the OMC acts as a TDC and offers new
insights about its disruptive action on the HPT axis, capable of supporting previous
investigations.
In summary, this doctoral thesis analysed the effects of prolonged exposure to
OMC on human vasculature for the first time. Our mechanistic and integrative in silico, ex
vivo, in vitro and in vivo approaches demonstrate that OMC impairs vascular homeostasis
in pregnant women with and without thyroid pathologies, acting through different
molecular initiating events (MIEs) and key events (Kes). Consequently, exposure to OMC
can induce the development of cardiovascular diseases. Complementation with in vivo
studies made it possible to prove the action of OMC on the HPT axis since the response to
OMC was altered in the presence of both thyroid pathologies. In silico studies compared
its thyroid modulatory activity to that of the endogenous hormone T3 and the antithyroid
drug PTU, which revealed interference at different levels in the HPT axis. Considering the
agonist and antagonist actions as an endocrine disruptor, we conclude that prolonged
exposure to OMC triggers pathophysiological mechanisms capable of inducing vascular
changes with implications for human thyroid health.
Diariamente, uma extensa e variada gama de contaminantes emergentes entra em contacto com os seres humanos. A exposição a estes compostos disruptores endócrinos (EDCs) não é isenta de riscos, e inclusivamente, tem sido associada a efeitos adversos em múltiplos sistemas humanos, incluindo o sistema cardíaco e vascular. Devido ao papel fundamental das hormonas da tiroide (TH) na homeostase vascular, os EDCs capazes de perturbar a homeostase tiroideia (compostos disruptivos tiroideus, TDCs) podem aumentar o risco de doenças cardiovasculares (CVD). No entanto, os mecanismos subjacentes à disrupção tiroideia associada à progressão ou desenvolvimento de CVD não são totalmente compreendidos. Atualmente, a disrupção endócrina é uma das maiores preocupações, e por isso, uma das maiores forças de investigação. A dirupção endócrina compreende um conjunto diversificado de órgãos-alvo, processos e modos de ação (MoA), com múltiplas interações e ações complexas. Períodos do desenvolvimento, como é o caso da gravidez, são particularmente sensíveis à disrupção endócrina e constituem uma área prioritária de investigação. Frequentemente, as mulheres grávidas usam uma variedade de produtos de cuidados pessoal contendo filtros UV. Os filtros UV-B estão desenhados para proteger os seres humanos contra os efeitos biológicos da radiação UV. No entanto, a sua utilização tem vindo a ser questionada, e algumas preocupações de toxicidade para a saúde humana têm surgido, demonstrando um papel de EDC para alguns dos filtros UV. O octilmetoxicinamato (OMC) é um dos filtros UV-B mais utilizados a nível mundial. No entanto, o OMC é também um EDC com efeitos para a saúde humana e meio ambiente, e cuja utilização permanece sob intensa controvérsia. A comunidade científica tem dado especial importância aos efeitos ambientais, demonstrando que o OMC causa efeitos graves sobre os recifes de coral e as espécies aquáticas, razão pela qual tem sido retirado do mercado em diferentes países desde 2018. Pelo contrário, os efeitos de disrupção endócrina em humanos têm sido negligenciados, apesar de estudos in vitro terem comprovado efeitos a nível estrogénico, e efeitos não consensuais em relação às atividades (anti)tiroideia e (anti)androgénica. Pelo exposto, é preocupante que os efeitos de um filtro UV amplamente usado a nível mundial, sejam praticamente desconhecidos para a saúde humana. No âmbito da minha dissertação de mestrado, nós demonstrámos que o OMC atua como um vasodilatador rápido da artéria umbilical humana (HUA). Embora este vasorelaxamento seja um efeito benéfico a curto prazo no sistema vascular, também observado com outros EDCs, a longo prazo todos os EDCs estudados comprometeram os principais mecanismos de vasorelaxação da HUA através de diferentes MoA. No caso do OMC, apenas um estudo avaliou os seus efeitos a curto-prazo sobre a vasculatura humana, não sendo conhecidos os efeitos da sua exposição a longo prazo para a saúde humana, até à realização da presente investigação. Desta forma, o objetivo principal desta tese de doutoramento foi compreender se a exposição ao filtro UV OMC compromete a função vascular humana na presença de disfunções tiroideias. A nossa hipótese é que a exposição ao OMC tem efeitos adversos sobre a vasculatura humana, alterando a expressão de diferentes recetores envolvidos nas funções da tiroide. Para atingir o nosso objetivo e responder à nossa hipótese de investigação, diferentes abordagens in silico (molecular docking), ex vivo, in vitro (HUA e células musculares lisas da artéria umbilical humana, HUASMC) e in vivo (peixes-zebra) foram delineadas. No primeiro trabalho de investigação, os efeitos da exposição a longo-prazo ao OMC foram analisados sobre a homeostasia vascular da HUA. As potenciais alterações nas respostas vasculares de proteínas e canais envolvidos nos processos contrácteis foram o foco da investigação. Os efeitos de 24 horas de exposição ao OMC (1, 10 e 50 μmol/L) foram avaliados nas respostas contráteis da HUA à serotonina (5-HT) e ao cloreto de potássio (KCl). Os dados evidenciaram que a exposição ao OMC alterou a homeostasia vascular da HUA, pelo que o seu MoA foi explorado em maior detalhe, estudando a atividade do monofosfato cíclico de guanosina (cGMP) e dos canais de Ca2+ (duas vias envolvidas no seu relaxamento e contração, respetivamente). A exposição prolongada ao OMC comprometeu o principal mecanismo vasorelaxante da HUA. Uma interferência na via de sinalização do óxido nítrico (NO)/guanil ciclase solúvel (sGC)/cGMP/proteína cinase G (PKG) e modulação dos canais de Ca2+ do tipo L, canais de potássio BKCa1.1 (subunidade α) e PKG foram os MoA implicados na diminuição da resposta contráctil. Este trabalho demonstrou que o OMC consegue comprometer a homeostasia vascular de mulheres grávidas e pode ter um papel na indução de doenças hipertensivas da gravidez. A HUA é regulada principalmente por mediadores locais (5-HT e a histamina, His). Os efeitos destes mediadores são induzidos por recetores de membrana, como os recetores acoplados à proteína G (GPCR) que, quando alterados, comprometem a saúde maternofetal. Níveis elevados de 5-HT e His aumentam a reatividade/sensibilidade da HUA a estes agentes vasoativos, aumentado a resistência vascular e induzindo préeclâmpsia (PE) e hipertensão gestacional. Por outro lado, está demonstrado que os EDCs são capazes de ativar recetores de membrana e alterar a transdução de sinal. Pelo exposto, e tendo em conta os resultados obtidos no primeiro estudo, o nosso segundo trabalho de investigação aprofundou o conhecimento sobre os efeitos da exposição prolongada ao OMC na homeostasia vascular, avaliando a modulação de recetores envolvidos nos processos contráteis da HUA. Neste trabalho, o foco da investigação foram a atividade e a expressão de diferentes recetores de 5-HT e His. Assim, os efeitos da exposição a 24 horas ao OMC (1, 10 e 50 μmol/L) foram avaliados nas respostas contráteis da HUA à 5-HT e His, usando diferentes agonistas e antagonistas específicos, nomeadamente, agonista dos recetores 5-HT2A (AMHT), agonista dos recetores 5-HT7 (AS19), agonista dos recetores 5- HT1B/1D (L69), agonista dos recetores H1 (BHI), agonista dos recetores H2 (dimaprito) e antagonista dos recetores H2 (cimetidina). Os nossos resultados demonstraram que a exposição ao OMC aumentou a reatividade da HUA aos agentes vasoativos em estudo. Consequentemente, e em linha com a investigação anterior, os nossos resultados denotam um papel potencial do OMC no desenvolvimento de doenças hipertensivas da gravidez, como a PE ou hipertensão gestacional. No terceiro trabalho de investigação, os efeitos da exposição a curto e a longo prazo ao OMC foram avaliados sobre a vasculatura de mulheres grávidas portadoras de hipotiroidismo. Apesar de ter sido sugerido que o OMC é um TDC devido à sua ação sobre os recetores de hormonas de tiroide (TR), os seus efeitos diruptivos sobre patologias tiroideias durante a gravidez nunca tinham sido avaliados. Assim, neste estudo, avaliámos os efeitos vasculares diruptivos do OMC em condições de hipotiroidismo. Simulações computacionais por docking molecular permitiram correlacionar as alterações vasculares com a ação do OMC sobre os TRα. Os nossos resultados indicaram que o OMC altera os padrões de contratilidade das HUA contraídas com 5-HT, His e KCl, possivelmente devido a uma interferência com os recetores de 5-HT e His e/ou um envolvimento dos canais de Ca2+ (conforme demonstrado nas duas investigações anteriores, na ausência de patologias tiroideias). A análise de docking molecular confirmou uma competição do OMC com a hormona endógena T3 pela ligação ao centro ativo do TRα, apoiando as alterações vasculares observadas. Em conjunto, os nossos dados demonstram que a exposição ao OMC altera a reatividade vascular de mulheres grávidas portadoras de patologias tiroideias, e desta forma, pode se relacionar com o aumento do risco e desenvolvimento de CVD. No quarto trabalho de investigação, embriões de peixe-zebra em desenvolvimento foram usados como modelo para estudar os efeitos da exposição ao OMC em condições de patologias tiroideias. Este trabalho teve como objetivo desvendar se e como a resposta à exposição ao OMC é alterada pelas condições de hipo- e hipertiroidismo de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento e se compromete o seu desenvolvimento normal. Neste sentido, hipo- e hipertiroidismo foram induzidos através da exposição exógena à PTU (propiltiouracil, um fármaco anti-tiroideu) ou à T3 (triiodotironina, hormona endógena), respetivamente. De seguida, os embriões foram expostos durante 120 horas ao OMC isolado e em mistura binária com a PTU e a T3. Em condições de desenvolvimento de hipo- ou hipertiroidismo, a exposição ao OMC comprometeu o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra através da indução de diversas malformações. Os edemas pericárdico e do saco vitelino, o retardamento da absorção do saco vitelino, a não insuflação da bexiga natatória, a curvatura da notocorda, e a falta de pigmentação foram as malformações mais prevalentes. Além disso, a exposição ao OMC nestas condições compromete o comportamento das larvas. A transcrição alterada de genes relacionados com o eixo hipotálamo-pituitária-tiroide (HPT) encontrada comprova a ação de TDC do OMC. Os nossos resultados sugerem que a resposta ao OMC é modificada na presença de patologias da tiroide, demonstrando efeitos num período do desenvolvimento mais sensível à desregulação endócrina, concordando com os resultados obtidos no trabalho de investigação III. Por fim, o quinto trabalho de investigação baseou-se no estudo das interações moleculares do OMC no eixo HPT e nas suas implicações para os seres humanos e para os peixes-zebra. Esta investigação, in silico, teve como objetivo desvendar os diversos modos de interação do OMC a diferentes níveis do eixo HPT, comparando-o ao da PTU e da T3. Os nossos resultados demonstraram uma ação do OMC a diferentes níveis no eixo HPT, com diferentes ações dependendo do alvo. A análise de docking molecular revelou ligações favoráveis ao recetor da hormona libertadora de corticotrofina (CRH) e à proteína transportadora das TH, a transtirretina (TTR). Além disso, foi observada uma competição com a T3 (atividade agonista inverso) para os TRα e TRβ. No geral, a ação do OMC parece levar a uma diminuição das TH, o que pode promover hipotiroidismo. Esta investigação comprova que o OMC atua como um TDC e oferece novas descobertas sobre a sua ação disruptiva no eixo HPT, capaz de apoiar as investigações anteriores. Em suma, esta tese de doutoramento analisou pela primeira vez os efeitos da exposição prolongada ao OMC na vasculatura humana. Através da nossa abordagem mecanística e integrativa in silico, ex vivo, in vitro e in vivo, demonstrámos que o OMC compromete a homeostase vascular em mulheres grávidas com e sem patologias da tiroide, atuando através de diferentes eventos de iniciação molecular (MIEs) e eventoschave (KEs). Consequentemente, a exposição ao OMC pode induzir o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. A complementação com os estudos in vivo permitiu comprovar a ação do OMC no eixo HPT, uma vez que a resposta ao OMC foi alterada na presença de ambas as patologias tiroideias. Através dos estudos in silico, a sua atividade moduladora tiroideia foi comparada à da hormona endógena T3 e ao fármaco anti-tiroideu PTU e revelou uma interferência a diferentes níveis no eixo HPT. Considerando as ações agonistas e antagonistas como um disruptor endócrino, concluímos que a exposição prolongada ao OMC desencadeia mecanismos fisiopatológicos capazes de induzir alterações vasculares com implicações na saúde tiroideia humana.
Diariamente, uma extensa e variada gama de contaminantes emergentes entra em contacto com os seres humanos. A exposição a estes compostos disruptores endócrinos (EDCs) não é isenta de riscos, e inclusivamente, tem sido associada a efeitos adversos em múltiplos sistemas humanos, incluindo o sistema cardíaco e vascular. Devido ao papel fundamental das hormonas da tiroide (TH) na homeostase vascular, os EDCs capazes de perturbar a homeostase tiroideia (compostos disruptivos tiroideus, TDCs) podem aumentar o risco de doenças cardiovasculares (CVD). No entanto, os mecanismos subjacentes à disrupção tiroideia associada à progressão ou desenvolvimento de CVD não são totalmente compreendidos. Atualmente, a disrupção endócrina é uma das maiores preocupações, e por isso, uma das maiores forças de investigação. A dirupção endócrina compreende um conjunto diversificado de órgãos-alvo, processos e modos de ação (MoA), com múltiplas interações e ações complexas. Períodos do desenvolvimento, como é o caso da gravidez, são particularmente sensíveis à disrupção endócrina e constituem uma área prioritária de investigação. Frequentemente, as mulheres grávidas usam uma variedade de produtos de cuidados pessoal contendo filtros UV. Os filtros UV-B estão desenhados para proteger os seres humanos contra os efeitos biológicos da radiação UV. No entanto, a sua utilização tem vindo a ser questionada, e algumas preocupações de toxicidade para a saúde humana têm surgido, demonstrando um papel de EDC para alguns dos filtros UV. O octilmetoxicinamato (OMC) é um dos filtros UV-B mais utilizados a nível mundial. No entanto, o OMC é também um EDC com efeitos para a saúde humana e meio ambiente, e cuja utilização permanece sob intensa controvérsia. A comunidade científica tem dado especial importância aos efeitos ambientais, demonstrando que o OMC causa efeitos graves sobre os recifes de coral e as espécies aquáticas, razão pela qual tem sido retirado do mercado em diferentes países desde 2018. Pelo contrário, os efeitos de disrupção endócrina em humanos têm sido negligenciados, apesar de estudos in vitro terem comprovado efeitos a nível estrogénico, e efeitos não consensuais em relação às atividades (anti)tiroideia e (anti)androgénica. Pelo exposto, é preocupante que os efeitos de um filtro UV amplamente usado a nível mundial, sejam praticamente desconhecidos para a saúde humana. No âmbito da minha dissertação de mestrado, nós demonstrámos que o OMC atua como um vasodilatador rápido da artéria umbilical humana (HUA). Embora este vasorelaxamento seja um efeito benéfico a curto prazo no sistema vascular, também observado com outros EDCs, a longo prazo todos os EDCs estudados comprometeram os principais mecanismos de vasorelaxação da HUA através de diferentes MoA. No caso do OMC, apenas um estudo avaliou os seus efeitos a curto-prazo sobre a vasculatura humana, não sendo conhecidos os efeitos da sua exposição a longo prazo para a saúde humana, até à realização da presente investigação. Desta forma, o objetivo principal desta tese de doutoramento foi compreender se a exposição ao filtro UV OMC compromete a função vascular humana na presença de disfunções tiroideias. A nossa hipótese é que a exposição ao OMC tem efeitos adversos sobre a vasculatura humana, alterando a expressão de diferentes recetores envolvidos nas funções da tiroide. Para atingir o nosso objetivo e responder à nossa hipótese de investigação, diferentes abordagens in silico (molecular docking), ex vivo, in vitro (HUA e células musculares lisas da artéria umbilical humana, HUASMC) e in vivo (peixes-zebra) foram delineadas. No primeiro trabalho de investigação, os efeitos da exposição a longo-prazo ao OMC foram analisados sobre a homeostasia vascular da HUA. As potenciais alterações nas respostas vasculares de proteínas e canais envolvidos nos processos contrácteis foram o foco da investigação. Os efeitos de 24 horas de exposição ao OMC (1, 10 e 50 μmol/L) foram avaliados nas respostas contráteis da HUA à serotonina (5-HT) e ao cloreto de potássio (KCl). Os dados evidenciaram que a exposição ao OMC alterou a homeostasia vascular da HUA, pelo que o seu MoA foi explorado em maior detalhe, estudando a atividade do monofosfato cíclico de guanosina (cGMP) e dos canais de Ca2+ (duas vias envolvidas no seu relaxamento e contração, respetivamente). A exposição prolongada ao OMC comprometeu o principal mecanismo vasorelaxante da HUA. Uma interferência na via de sinalização do óxido nítrico (NO)/guanil ciclase solúvel (sGC)/cGMP/proteína cinase G (PKG) e modulação dos canais de Ca2+ do tipo L, canais de potássio BKCa1.1 (subunidade α) e PKG foram os MoA implicados na diminuição da resposta contráctil. Este trabalho demonstrou que o OMC consegue comprometer a homeostasia vascular de mulheres grávidas e pode ter um papel na indução de doenças hipertensivas da gravidez. A HUA é regulada principalmente por mediadores locais (5-HT e a histamina, His). Os efeitos destes mediadores são induzidos por recetores de membrana, como os recetores acoplados à proteína G (GPCR) que, quando alterados, comprometem a saúde maternofetal. Níveis elevados de 5-HT e His aumentam a reatividade/sensibilidade da HUA a estes agentes vasoativos, aumentado a resistência vascular e induzindo préeclâmpsia (PE) e hipertensão gestacional. Por outro lado, está demonstrado que os EDCs são capazes de ativar recetores de membrana e alterar a transdução de sinal. Pelo exposto, e tendo em conta os resultados obtidos no primeiro estudo, o nosso segundo trabalho de investigação aprofundou o conhecimento sobre os efeitos da exposição prolongada ao OMC na homeostasia vascular, avaliando a modulação de recetores envolvidos nos processos contráteis da HUA. Neste trabalho, o foco da investigação foram a atividade e a expressão de diferentes recetores de 5-HT e His. Assim, os efeitos da exposição a 24 horas ao OMC (1, 10 e 50 μmol/L) foram avaliados nas respostas contráteis da HUA à 5-HT e His, usando diferentes agonistas e antagonistas específicos, nomeadamente, agonista dos recetores 5-HT2A (AMHT), agonista dos recetores 5-HT7 (AS19), agonista dos recetores 5- HT1B/1D (L69), agonista dos recetores H1 (BHI), agonista dos recetores H2 (dimaprito) e antagonista dos recetores H2 (cimetidina). Os nossos resultados demonstraram que a exposição ao OMC aumentou a reatividade da HUA aos agentes vasoativos em estudo. Consequentemente, e em linha com a investigação anterior, os nossos resultados denotam um papel potencial do OMC no desenvolvimento de doenças hipertensivas da gravidez, como a PE ou hipertensão gestacional. No terceiro trabalho de investigação, os efeitos da exposição a curto e a longo prazo ao OMC foram avaliados sobre a vasculatura de mulheres grávidas portadoras de hipotiroidismo. Apesar de ter sido sugerido que o OMC é um TDC devido à sua ação sobre os recetores de hormonas de tiroide (TR), os seus efeitos diruptivos sobre patologias tiroideias durante a gravidez nunca tinham sido avaliados. Assim, neste estudo, avaliámos os efeitos vasculares diruptivos do OMC em condições de hipotiroidismo. Simulações computacionais por docking molecular permitiram correlacionar as alterações vasculares com a ação do OMC sobre os TRα. Os nossos resultados indicaram que o OMC altera os padrões de contratilidade das HUA contraídas com 5-HT, His e KCl, possivelmente devido a uma interferência com os recetores de 5-HT e His e/ou um envolvimento dos canais de Ca2+ (conforme demonstrado nas duas investigações anteriores, na ausência de patologias tiroideias). A análise de docking molecular confirmou uma competição do OMC com a hormona endógena T3 pela ligação ao centro ativo do TRα, apoiando as alterações vasculares observadas. Em conjunto, os nossos dados demonstram que a exposição ao OMC altera a reatividade vascular de mulheres grávidas portadoras de patologias tiroideias, e desta forma, pode se relacionar com o aumento do risco e desenvolvimento de CVD. No quarto trabalho de investigação, embriões de peixe-zebra em desenvolvimento foram usados como modelo para estudar os efeitos da exposição ao OMC em condições de patologias tiroideias. Este trabalho teve como objetivo desvendar se e como a resposta à exposição ao OMC é alterada pelas condições de hipo- e hipertiroidismo de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento e se compromete o seu desenvolvimento normal. Neste sentido, hipo- e hipertiroidismo foram induzidos através da exposição exógena à PTU (propiltiouracil, um fármaco anti-tiroideu) ou à T3 (triiodotironina, hormona endógena), respetivamente. De seguida, os embriões foram expostos durante 120 horas ao OMC isolado e em mistura binária com a PTU e a T3. Em condições de desenvolvimento de hipo- ou hipertiroidismo, a exposição ao OMC comprometeu o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra através da indução de diversas malformações. Os edemas pericárdico e do saco vitelino, o retardamento da absorção do saco vitelino, a não insuflação da bexiga natatória, a curvatura da notocorda, e a falta de pigmentação foram as malformações mais prevalentes. Além disso, a exposição ao OMC nestas condições compromete o comportamento das larvas. A transcrição alterada de genes relacionados com o eixo hipotálamo-pituitária-tiroide (HPT) encontrada comprova a ação de TDC do OMC. Os nossos resultados sugerem que a resposta ao OMC é modificada na presença de patologias da tiroide, demonstrando efeitos num período do desenvolvimento mais sensível à desregulação endócrina, concordando com os resultados obtidos no trabalho de investigação III. Por fim, o quinto trabalho de investigação baseou-se no estudo das interações moleculares do OMC no eixo HPT e nas suas implicações para os seres humanos e para os peixes-zebra. Esta investigação, in silico, teve como objetivo desvendar os diversos modos de interação do OMC a diferentes níveis do eixo HPT, comparando-o ao da PTU e da T3. Os nossos resultados demonstraram uma ação do OMC a diferentes níveis no eixo HPT, com diferentes ações dependendo do alvo. A análise de docking molecular revelou ligações favoráveis ao recetor da hormona libertadora de corticotrofina (CRH) e à proteína transportadora das TH, a transtirretina (TTR). Além disso, foi observada uma competição com a T3 (atividade agonista inverso) para os TRα e TRβ. No geral, a ação do OMC parece levar a uma diminuição das TH, o que pode promover hipotiroidismo. Esta investigação comprova que o OMC atua como um TDC e oferece novas descobertas sobre a sua ação disruptiva no eixo HPT, capaz de apoiar as investigações anteriores. Em suma, esta tese de doutoramento analisou pela primeira vez os efeitos da exposição prolongada ao OMC na vasculatura humana. Através da nossa abordagem mecanística e integrativa in silico, ex vivo, in vitro e in vivo, demonstrámos que o OMC compromete a homeostase vascular em mulheres grávidas com e sem patologias da tiroide, atuando através de diferentes eventos de iniciação molecular (MIEs) e eventoschave (KEs). Consequentemente, a exposição ao OMC pode induzir o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. A complementação com os estudos in vivo permitiu comprovar a ação do OMC no eixo HPT, uma vez que a resposta ao OMC foi alterada na presença de ambas as patologias tiroideias. Através dos estudos in silico, a sua atividade moduladora tiroideia foi comparada à da hormona endógena T3 e ao fármaco anti-tiroideu PTU e revelou uma interferência a diferentes níveis no eixo HPT. Considerando as ações agonistas e antagonistas como um disruptor endócrino, concluímos que a exposição prolongada ao OMC desencadeia mecanismos fisiopatológicos capazes de induzir alterações vasculares com implicações na saúde tiroideia humana.
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Octinoxato Disrupção endócrina Homeostasia vascular Hipotiroidismo Hipertiroidismo Artéria umbilical humana Peixe-zebra Docking molecular Octinoxate Hypothyroidism - Hyperthyroidism Human umbilical artery