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Authors
Abstract(s)
Despite all the efforts that have been done, cancer remains as one of the most common and deadliest diseases in the whole world. Surgery can be an effective strategy to treat this disease if the cancer is diagnosed at an early stage. In a more advanced stage of this disease, chemotherapy and radiotherapy are the most applied therapeutic strategies. However, these conventional approaches lack efficacy and selectivity towards cancer cells, causing several side effects in the patients such as hair loss, nausea, and severe weakness. These drawbacks of the clinically available therapeutics highlight the urgent need for developing new anticancer approaches with greater efficacy and safety.
To face this challenge, the nanomaterials’ mediated phototherapy is one of the most promising strategies. Regarding this therapeutic modality, it is important to consider two main aspects: i) the physicochemical properties of the nanomaterials (e.g., size, corona composition) and ii) the optical properties of the laser (e.g., wavelength, intensity) and of the therapeutic agent (e.g., molar extinction coefficient, photothermal and photodynamic efficiencies).
In what concerns the first point, the nanomaterials’ size, charge, shape, and corona composition play an important role in their ability to reach the tumor site. Classically, the optimization of the nanomaterials’ size has been intensively pursued to allow these nanostructures to accumulate at the tumor site by exploiting the tumor’s leaky vasculature (i.e., to take advantage from the so-called Enhanced Permeability and Retention effect). However, recently it was unveiled that dynamic vents (also known as eruptions) occur spontaneously at the tumor vasculature, facilitating nanostructures extravasation into the tumor site. This new phenomenon led to a paradigm shift, and thus, currently, researchers are focused on the optimization of the nanoparticles’ corona for improving their tumor uptake (i.e., to increase their blood circulation time and hence their likelihood to benefit from these dynamic vents).
To improve the nanostructures’ blood circulation time and favor their tumor uptake, these nano-systems have been mainly coated with poly(ethylene glycol) (PEG). However, recently it was uncovered that PEGylated nanomaterials suffer from the Accelerated Blood Clearance phenomenon. Therefore, at the time of the first administration of PEGylated nanomaterials, anti-PEG antibodies are created. Then, these anti-PEG antibodies mediate the rapid clearance of the PEGylated nanoparticles in subsequent administrations. Due to the immunogenicity displayed by PEG-based coatings, it is crucial to develop and validate novel materials capable of improving the nanostructures’ biological properties.
The efficacy of nanomaterials-based phototherapies also depends on the optical properties of the laser and of the photoresponsive agent. In this regard, the use of near infrared (NIR; 750-1000 nm) light is of utmost importance since it does not interact significantly with major body components (e.g., water, melanin, collagen) and achieves a high penetration depth (up to about 2 cm). Moreover, the laser power density and irradiation time can also affect the therapeutic outcome. In this way, phototherapies based on NIR light-responsive nanomaterials have been showing promising results. In this type of therapy, after the nanomaterials’ tumor uptake, this zone is irradiated with NIR light. Upon interaction with this radiation, the nanomaterials can produce a temperature increase (photothermal therapy) and/or reactive oxygen species (photodynamic therapy), which cause damages on cancer cells.
Among the several NIR light responsive agents, IR780 stands out due to its high versatility. This prototypic heptamethine cyanine has multimodal properties since it can be used for both photothermal therapy and photodynamic therapy as well as for imaging applications (IR780 emits fluorescence in the NIR). However, this small molecule presents acute toxicity and low solubility, hindering its direct application in cancer therapy. In this way, encapsulating IR780 in nanomaterials can be pursued to surpass these disadvantages. However, most of the IR780-based nanomaterials have been produced using PEG in their corona. Considering the recent studies demonstrating the immunogenicity of PEGylated nanostructures, it is of utmost importance to develop new IR780-based nanoparticles that are functionalized with PEG alternatives.
In this way, the main goal of the workplan developed during this Doctoral thesis was to validate the potential of novel materials, based on sulfobetaine methacrylate (SBMA) and Poly(2-ethyl-2-oxazoline) (PEtOx), in the coating of nanostructures incorporating IR780 for application in cancer photothermal therapy.
This thesis includes two chapters presenting research work. In the first research work (Chapter 3), Bovine Serum Albumin (BSA) was grafted with SBMA, for the first time, being this polymer (SBMA-BSA) employed to encapsulate IR780 through the nanoprecipitation technique (IR/SBMA-BSA NPs). The produced nanoparticles presented an ideal size (≈ 96 nm) and surface charge (≈ -9 mV) for cancer-related applications. As importantly, the SBMA functionalization improved the colloidal stability of the nanostructures in different media as well as their uptake by breast cancer cells. In the phototherapeutic assays, the IR/SBMA-BSA NPs in combination with NIR light could decrease the cancer cells’ viability to just 12 %.
In the second research work (Chapter 4), a novel amphiphilic PEtOx-IR780 conjugate was produced. For that, the cyclohexenyl ring of IR780 was chemically attached to thiol-terminated PEtOx (PEtOx-IR conjugate). Afterwards, PEtOx-IR and D-α-tocopheryl succinate (TOS) were combined through the nanoprecipitation technique, yielding PEtOx-IR/TOS NPs. These nanoparticles presented a size (≈ 190 nm) and surface charge (≈ -8 mV) compatible with anticancer applications. As importantly, the PEtOx-IR/TOS NPs also presented an optimal colloidal stability. The PEtOx-IR/TOS NPs could be successfully internalized by cancer cells. In the phototherapeutic assays, the combination of PEtOx-IR/TOS NPs with NIR light could decrease the viability of breast cancer cells (2D in vitro cancer models) to 9 %, and the heterotypic breast cancer spheroids’ (3D in vitro cancer models) viability was also reduced to just 15 %.
Overall, the results obtained in this thesis validate the potential of SBMA-brushes and PEtOx in the coating of IR780-based nanomaterials. Moreover, these novel IR780-based nanomaterials also displayed a good in vitro performance, highlighting their potential for cancer photothermal therapy.
Apesar de todo o trabalho de investigação que tem sido desenvolvido, o cancro continua a ser uma das doenças mais comuns e uma das mais mortíferas em todo o mundo. Num estadio inicial, a remoção cirúrgica do tumor é a abordagem mais aplicada no tratamento deste. Em fases mais avançadas da doença, a quimioterapia e a radioterapia são as terapêuticas mais usadas. No entanto, estes tratamentos apresentam baixa eficácia e induzem toxicidade sistémica, causando diversos efeitos secundários no paciente, tais como perda de cabelo, náuseas, vómitos e fadiga. Estas limitações das terapêuticas utilizadas em meio clínico fazem com que exista uma necessidade urgente em desenvolver novas terapias anticancerígenas caracterizadas por uma maior eficácia e segurança. Neste contexto, nos últimos anos, as fototerapias mediadas por nanomateriais têm vindo a mostrar resultados muito promissores. Neste tipo de abordagem terapêutica é importante ter em consideração dois aspetos: i) as propriedades físico-químicas dos nanomateriais (por exemplo, tamanho, composição de superfície), e ii) as propriedades óticas do laser (por exemplo, comprimento de onda, intensidade) e do agente fototerapêutico (por exemplo, coeficiente de extinção molar, eficiência fototérmica e dinâmica). O tamanho, a carga, a forma e a composição do revestimento (corona) das nanopartículas são fatores que influenciam a sua capacidade para atingirem o ambiente tumoral. Por norma, a otimização do tamanho dos nanomateriais é um dos parâmetros mais estudados, de modo a aumentar a sua acumulação no tumor através do efeito de permeabilização e retenção aumentados (do inglês: Enhanced Permeability and Retention effect). No entanto, recentemente foi descrito um fenómeno que ocorre espontaneamente na vasculatura do tumor denominado por “erupções dinâmicas”. Estas erupções espontâneas facilitam o extravasamento das nanopartículas para o local do tumor. Este novo fenómeno conduziu a uma mudança de paradigma, e atualmente os investigadores estão focados na otimização do revestimento das nanopartículas. O objetivo passa por aumentar o tempo de circulação dos nanomateriais na corrente sanguínea, incrementando assim a probabilidade destes de beneficiarem das erupções dinâmicas, promovendo assim a sua acumulação na zona tumoral. De modo a melhorar o tempo de circulação sanguínea dos nanomateriais e aumentar a sua acumulação no tumor, estes nanossistemas têm sido revestidos com Polietileno glicol PEG). Contudo, recentemente foi descrito que os nanomateriais “PEGuilados” sofrem do fenómeno de eliminação acelerada do sangue (do inglês Accelerated Blood Clearance). Logo após a primeira administração dos nanomateriais “PEGuilados” são criados anticorpos anti-PEG. Assim, estes anticorpos vão mediar a rápida eliminação das nanopartículas nas administrações seguintes. Devido à imunogenicidade apresentada por algumas nanoestruturas “PEGuiladas”, torna-se crucial desenvolver/avaliar a capacidade de novos revestimentos em melhorar as propriedades biológicas dos nanomateriais. A eficácia das fototerapias mediadas por nanomateriais depende também das propriedades óticas do laser e do agente foto-responsivo. De facto, a utilização de luz na região do infravermelho próximo (NIR; 750-1000 nm) é de extrema importância, uma vez que esta radiação não interage com os componentes biológicos, tais como a água, a melanina ou o colagénio e ainda apresenta a capacidade de penetrar profundamente nos tecidos (até cerca de 2 cm). Para além disto, a intensidade da luz emitida pelo laser e o tempo de irradiação podem também afetar a performance terapêutica. Desta forma, as fototerapias baseadas em nanomateriais que são responsivos à luz NIR têm-se demonstrado muito promissoras. Após a acumulação dos nanomateriais no tumor, esta zona é irradiada com luz NIR, levando à produção de um aumento de temperatura (terapia fototérmica) e/ou de espécies reativas de oxigénio (terapia fotodinâmica), culminando em danos nas células cancerígenas. De entre os diversos agentes responsivos à luz NIR, o IR780 destaca-se devido à sua elevada polivalência. Esta pequena molécula apresenta a capacidade de ser usada tanto para terapia fototérmica como para terapia fotodinâmica e, para além disto, ainda apresenta capacidade de ser utilizada em imagiologia, uma vez que emite fluorescência. No entanto, esta heptametina cianina apresenta toxicidade aguda e ainda baixa solubilidade em água, o que impede a sua aplicação direta na terapia do cancro. A encapsulação de IR780 em nanopartículas pode permitir ultrapassar estas desvantagens. Porém, a maioria dos nanomateriais que incorporam IR780 têm sido produzidos usando PEG no seu revestimento. Tendo em conta os estudos recentes que demonstram a imunogenicidade das nanoestruturas “PEGuiladas”, é de extrema importância desenvolver novos nanomateriais contendo IR780 que sejam desprovidos de qualquer revestimento à base de PEG. Assim, o desenvolvimento do plano de trabalhos proposto neste doutoramento teve como principal objetivo validar o potencial de novos materiais à base de metacrilato de sulfobetaína (do inglês: sulfobetaine methacrylate, SBMA) e de poli(2-etil-2-oxazolina) (do inglês: Poly(2-ethyl-2-oxazoline), PEtOx), no revestimento de nanoestruturas contendo IR780 para aplicação na terapia fototérmica do cancro. Nesta tese são apresentados dois capítulos com trabalho de investigação. No primeiro trabalho de investigação (Capítulo 3), a albumina de soro bovino (do inglês: Bovine Serum Albumin, BSA) foi enxertada com SBMA. Este novo polímero anfifílico foi posteriormente combinado com IR780 através da técnica de nanoprecipitação de forma a obterem-se nanopartículas (IR/SBMA-BSA NPs). As nanopartículas produzidas apresentaram um tamanho (≈ 96 nm) e uma carga de superfície (≈ -9 mV) adequados para serem aplicadas na terapia do cancro. A funcionalização de superfície das nanopartículas com SBMA revelou ser bastante importante uma vez que aumentou a estabilidade coloidal em diferentes meios, bem como a sua internalização em células do cancro da mama. Nestas mesmas células, a ação combinada das IR/SBMA-BSA NPs com a luz NIR conseguiu diminuir a viabilidade celular para apenas 12 %. No segundo trabalho de investigação (Capítulo 4), procedeu-se à preparação de um conjugado de IR780, tendo para tal ligado quimicamente esta molécula ao PEtOx. Este novo conjugado PEtOx-IR780 foi posteriormente combinado com succinato de D-α-tocoferol (TOS) através da técnica de nanoprecipitação, obtendo-se a nanoformulação denominada por PEtOx-IR/TOS NPs. Estas nanopartículas apresentaram um tamanho (≈ 190 nm) e uma carga de superfície (≈ -8 mV) que são compatíveis com aplicações anticancerígenas. As PEtOx-IR/TOS NPs revelaram uma estabilidade coloidal ótima bem como capacidade para serem internalizadas pelas células cancerígenas. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação de PEtOx-IR/TOS NPs com luz NIR consegue diminuir a viabilidade de células do cancro da mama (modelos 2D de cultura celular in vitro) para 9 %, e nos esferóides heterotípicos de cancro da mama (modelos 3D de cultura celular in vitro) a viabilidade diminuiu para apenas 15 %. Os resultados apresentados nesta tese revelam que os novos nanomateriais à base de IR780 produzidos têm potencial para aplicação em terapia fototérmica do cancro da mama.
Apesar de todo o trabalho de investigação que tem sido desenvolvido, o cancro continua a ser uma das doenças mais comuns e uma das mais mortíferas em todo o mundo. Num estadio inicial, a remoção cirúrgica do tumor é a abordagem mais aplicada no tratamento deste. Em fases mais avançadas da doença, a quimioterapia e a radioterapia são as terapêuticas mais usadas. No entanto, estes tratamentos apresentam baixa eficácia e induzem toxicidade sistémica, causando diversos efeitos secundários no paciente, tais como perda de cabelo, náuseas, vómitos e fadiga. Estas limitações das terapêuticas utilizadas em meio clínico fazem com que exista uma necessidade urgente em desenvolver novas terapias anticancerígenas caracterizadas por uma maior eficácia e segurança. Neste contexto, nos últimos anos, as fototerapias mediadas por nanomateriais têm vindo a mostrar resultados muito promissores. Neste tipo de abordagem terapêutica é importante ter em consideração dois aspetos: i) as propriedades físico-químicas dos nanomateriais (por exemplo, tamanho, composição de superfície), e ii) as propriedades óticas do laser (por exemplo, comprimento de onda, intensidade) e do agente fototerapêutico (por exemplo, coeficiente de extinção molar, eficiência fototérmica e dinâmica). O tamanho, a carga, a forma e a composição do revestimento (corona) das nanopartículas são fatores que influenciam a sua capacidade para atingirem o ambiente tumoral. Por norma, a otimização do tamanho dos nanomateriais é um dos parâmetros mais estudados, de modo a aumentar a sua acumulação no tumor através do efeito de permeabilização e retenção aumentados (do inglês: Enhanced Permeability and Retention effect). No entanto, recentemente foi descrito um fenómeno que ocorre espontaneamente na vasculatura do tumor denominado por “erupções dinâmicas”. Estas erupções espontâneas facilitam o extravasamento das nanopartículas para o local do tumor. Este novo fenómeno conduziu a uma mudança de paradigma, e atualmente os investigadores estão focados na otimização do revestimento das nanopartículas. O objetivo passa por aumentar o tempo de circulação dos nanomateriais na corrente sanguínea, incrementando assim a probabilidade destes de beneficiarem das erupções dinâmicas, promovendo assim a sua acumulação na zona tumoral. De modo a melhorar o tempo de circulação sanguínea dos nanomateriais e aumentar a sua acumulação no tumor, estes nanossistemas têm sido revestidos com Polietileno glicol PEG). Contudo, recentemente foi descrito que os nanomateriais “PEGuilados” sofrem do fenómeno de eliminação acelerada do sangue (do inglês Accelerated Blood Clearance). Logo após a primeira administração dos nanomateriais “PEGuilados” são criados anticorpos anti-PEG. Assim, estes anticorpos vão mediar a rápida eliminação das nanopartículas nas administrações seguintes. Devido à imunogenicidade apresentada por algumas nanoestruturas “PEGuiladas”, torna-se crucial desenvolver/avaliar a capacidade de novos revestimentos em melhorar as propriedades biológicas dos nanomateriais. A eficácia das fototerapias mediadas por nanomateriais depende também das propriedades óticas do laser e do agente foto-responsivo. De facto, a utilização de luz na região do infravermelho próximo (NIR; 750-1000 nm) é de extrema importância, uma vez que esta radiação não interage com os componentes biológicos, tais como a água, a melanina ou o colagénio e ainda apresenta a capacidade de penetrar profundamente nos tecidos (até cerca de 2 cm). Para além disto, a intensidade da luz emitida pelo laser e o tempo de irradiação podem também afetar a performance terapêutica. Desta forma, as fototerapias baseadas em nanomateriais que são responsivos à luz NIR têm-se demonstrado muito promissoras. Após a acumulação dos nanomateriais no tumor, esta zona é irradiada com luz NIR, levando à produção de um aumento de temperatura (terapia fototérmica) e/ou de espécies reativas de oxigénio (terapia fotodinâmica), culminando em danos nas células cancerígenas. De entre os diversos agentes responsivos à luz NIR, o IR780 destaca-se devido à sua elevada polivalência. Esta pequena molécula apresenta a capacidade de ser usada tanto para terapia fototérmica como para terapia fotodinâmica e, para além disto, ainda apresenta capacidade de ser utilizada em imagiologia, uma vez que emite fluorescência. No entanto, esta heptametina cianina apresenta toxicidade aguda e ainda baixa solubilidade em água, o que impede a sua aplicação direta na terapia do cancro. A encapsulação de IR780 em nanopartículas pode permitir ultrapassar estas desvantagens. Porém, a maioria dos nanomateriais que incorporam IR780 têm sido produzidos usando PEG no seu revestimento. Tendo em conta os estudos recentes que demonstram a imunogenicidade das nanoestruturas “PEGuiladas”, é de extrema importância desenvolver novos nanomateriais contendo IR780 que sejam desprovidos de qualquer revestimento à base de PEG. Assim, o desenvolvimento do plano de trabalhos proposto neste doutoramento teve como principal objetivo validar o potencial de novos materiais à base de metacrilato de sulfobetaína (do inglês: sulfobetaine methacrylate, SBMA) e de poli(2-etil-2-oxazolina) (do inglês: Poly(2-ethyl-2-oxazoline), PEtOx), no revestimento de nanoestruturas contendo IR780 para aplicação na terapia fototérmica do cancro. Nesta tese são apresentados dois capítulos com trabalho de investigação. No primeiro trabalho de investigação (Capítulo 3), a albumina de soro bovino (do inglês: Bovine Serum Albumin, BSA) foi enxertada com SBMA. Este novo polímero anfifílico foi posteriormente combinado com IR780 através da técnica de nanoprecipitação de forma a obterem-se nanopartículas (IR/SBMA-BSA NPs). As nanopartículas produzidas apresentaram um tamanho (≈ 96 nm) e uma carga de superfície (≈ -9 mV) adequados para serem aplicadas na terapia do cancro. A funcionalização de superfície das nanopartículas com SBMA revelou ser bastante importante uma vez que aumentou a estabilidade coloidal em diferentes meios, bem como a sua internalização em células do cancro da mama. Nestas mesmas células, a ação combinada das IR/SBMA-BSA NPs com a luz NIR conseguiu diminuir a viabilidade celular para apenas 12 %. No segundo trabalho de investigação (Capítulo 4), procedeu-se à preparação de um conjugado de IR780, tendo para tal ligado quimicamente esta molécula ao PEtOx. Este novo conjugado PEtOx-IR780 foi posteriormente combinado com succinato de D-α-tocoferol (TOS) através da técnica de nanoprecipitação, obtendo-se a nanoformulação denominada por PEtOx-IR/TOS NPs. Estas nanopartículas apresentaram um tamanho (≈ 190 nm) e uma carga de superfície (≈ -8 mV) que são compatíveis com aplicações anticancerígenas. As PEtOx-IR/TOS NPs revelaram uma estabilidade coloidal ótima bem como capacidade para serem internalizadas pelas células cancerígenas. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação de PEtOx-IR/TOS NPs com luz NIR consegue diminuir a viabilidade de células do cancro da mama (modelos 2D de cultura celular in vitro) para 9 %, e nos esferóides heterotípicos de cancro da mama (modelos 3D de cultura celular in vitro) a viabilidade diminuiu para apenas 15 %. Os resultados apresentados nesta tese revelam que os novos nanomateriais à base de IR780 produzidos têm potencial para aplicação em terapia fototérmica do cancro da mama.
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