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Authors
Abstract(s)
Blood dyscrasias are pathological conditions in which any of the constituents of the blood are structuraly or functionally abnormal. Polycythemia Vera (PV) and Secondary Polycythemia (SP) are two disorders characterized by the increase of the amount of red blood cells (RBC) while hereditary hemochromatosis (HH) and secondary hemochromatosis (SH) are associated with iron overload. It is currently believed that RBC play an important role in T cells growth and survival, which may suggest that anomalies in red blood cells could be associated with lymphocyte alterations. The few immunological studies conducted in erythrocytosis patients reported an increase of CD4+/CD8+ ratio as well as an increase in the percentage of T CD4+CD25+FoxP3+ cells in patients with PV. A number of earlier studies reported anomalies in CD8+ T populations in patients with HH. The main objective of this work was to ascertain if patients with anomalies in RBC numbers have alterations in lymphocyte populations and whether therapeutic phlebotomy influences these populations. In order to do that, blood samples from nineteen healthy donors, seventeen HH patients, three SH patients, three PV patients and ten SP patients were used as a source of peripheral blood mononuclear cells and RBC. The percentages of lymphocyte populations as well as the extent of T cell proliferation and survival were determined by flow cytometry. It was observed that the percentage of NK cells was higher in all groups of patients when compared to controls. However, this increase was statistically significant only in HH and SP patients. In contrasts, B cells were significantly decreased in HH, PV and SP in relation to controls. When the influence of RBC on T cell proliferation and survival was ascertained, it was possible to note that cells from PV patients tended to proliferate less than the cells from the other groups of patients and controls. Unexpectedly, it was also observed that RBC by themselves were able to induce T cell proliferation in the absence of any mitogen stimulus. This effect was most striking with RBC obtained from buffy coats of regular blood donors. These results suggest that an excess of circulating RBC and/or iron are associated with alterations in NK and B populations. Further studies are needed in order to ascertain if the anomalies in NK and B cells include alterations of other parameters, like the expression of surface receptors. More importantly, based on the evidences of the effect of the addition of RBC from controls to cultures, it is necessary to perform extensive studies to elucidate the implications of RBC storage and aging on T cell proliferation and survival.
As discrasias sanguíneas são patologias associadas a alterações funcionais ou estruturais de um qualquer constituinte do sangue. A Policitemia Vera (PV) e a Policitemia Secundária (SP), inseridas neste grupo, são doenças associadas com o aumento da quantidade de eritrócitos (eritrocitose) na corrente sanguínea. O aumento da quantidade de glóbulos vermelhos (RBC) na PV parece estar maioritariamente associado à presença de uma mutação na cinase Janus 2 (JAK2) que culmina na ativação constitutiva desta cinase nas células hematopoiéticas e consequente produção excessiva de RBC. Contrariamente à PV, a SP resulta de mecanismos que não envolvem alterações nas células progenitoras da medula óssea, estando maioritariamente associada à presença de outras patologias. Por sua vez, a Hemocromatose Hereditária (HH) e a Hemocromatose Secundária (SH) são doenças associadas ao aumento da quantidade de ferro e também elas são inseridas no grupo das discrasias sanguíneas. Enquanto a HH é uma doença associada a mutações no gene HFE ou a alterações nos mediadores envolvidos na absorção e transporte de ferro, a SH é uma patologia que surge maioritariamente como consequência da necessidade de transfusões sanguíneas recorrentes verificada em algumas doenças. Atualmente, e tendo em conta as evidências experimentais, pensa-se que os RBC estão envolvidos em várias funções para além do transporte de gases metabólicos e nutrientes para os tecidos. De facto, a presença de RBC em culturas com linfócitos humanos isolados do sangue periférico e estimulados com mitogénios é responsável pelo aumento da proliferação e sobrevivência de linfócitos T. Nos poucos estudos prévios onde foram estudadas populações de linfócitos em doentes com PV e SP, foi descrito um aumento do rácio CD4+/CD8+, assim como um aumento da percentagem e da capacidade supressora de linfócitos T CD4+ reguladores (CD4+CD25+FoxP3+) no sangue periférico de doentes com PV. A nível da HH e da SH, o panorama é distinto, tendo sido realizados estudos imunológicos com maior frequência, sendo que a maioria reporta anomalias a nível das populações de linfócitos T CD8+, incluindo a diminuição da população T CD8+ e o aumento da percentagem de células CD8+CD28-. O objetivo primordial deste trabalho foi avaliar se doentes com anomalias no número de RBC apresentavam alterações fenotípicas e funcionais a nível das diferentes populações de linfócitos e se estas alterações poderiam ser influenciadas pelo tratamento com flebotomias. Para isso, foi realizado o estudo fenotípico das populações de linfócitos em doentes com PV, SP, HH e SH, assim como num grupo controlo constituído por dadores regulares de sangue. Para além disso, foi também avaliada a influência da presença de RBC de doentes e controlos na proliferação e sobrevivência de linfócitos T, recorrendo à realização de culturas com células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As PBMC usadas neste estudo foram isoladas a partir de amostras de sangue periférico de dezanove dadores saudáveis, dezassete doentes com HH, três doentes com SH, três doentes com PV e dez doentes com SP. As percentagens de populações de linfócitos, assim como a percentagem de proliferação e sobrevivência das células em cultura foram determinadas através da análise por citómetria de fluxo. Várias condições de cultura foram incluídas neste estudo, mais especificamente a estimulação das células com um mitogénio de linfócitos T ou a presença de RBC autólogos ou heterólogos. Quando as percentagens das diferentes populações de linfócitos foram analisadas, foi possível observar que a percentagem de linfócitos NK se encontrava elevada em todos os grupos de doentes em comparação ao grupo de indivíduos saudáveis, no entanto este aumento só era estatisticamente significativo nos grupos de doentes com HH e SP. Em contraste, a percentagem de linfócitos B encontrava-se significativamente diminuída nos doentes com HH, PV e SP em relação ao grupo controlo. Outras diferenças, nomeadamente o aumento das populações de linfócito T CD8+ e CD8+CD28+ nos doentes com SH e SP, assim como a diminuição destas populações em doentes com PV, foram também observadas. Em relação à monotorização das percentagens de linfócitos dos doentes ao longo do tratamento com flebotomias, foi verificada uma tendência para a diminuição da percentagem de linfócitos NK em cinco dos sete doentes seguidos. Em relação à influência dos RBC nas culturas de PBMC, apenas ligeiras diferenças em termos de proliferação e sobrevivência foram observadas, com a excepção das culturas com PBMC de doentes com PV onde, de modo geral, se registou uma menor percentagem de proliferação em todas as condições de cultura em comparação com os restantes grupos de doentes e com o grupo controlo, provavelmente devido ao aumento da população de linfócitos T CD4+ reguladores no sangue periférico descrito recentemente em doentes com PV. No entanto, e talvez uma das mais inesperadas observações relativa às experiências de proliferação, foi o facto de ser constantemente verificado que os próprios RBC, principalmente os RBC isolados de dadores saudáveis, eram capazes de induzir proliferação de uma população de linfócitos T na ausência de estímulo e sem a observação do aumento de tamanho e complexidade desta população (blastos), independentemente da origem dos PBMC onde eram adicionados. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que o excesso de RBC, bem como o excesso de ferro em circulação, podem estar associados com alterações a nível dos linfócitos NK e B. Futuramente, é necessário realizar mais estudos com vista a determinar se para além das alterações a nível da quantidade de linfócitos NK e B associadas às discrasias sanguíneas, também se encontram anomalias noutros parâmetros destas populações, como por exemplo na expressão de recetores superficiais. Existe também a necessidade de alargar o período de monotorização dos doentes tratados com flebotomias, assim como a necessidade de aumentar o número de indivíduos estudados, tendo em conta que este foi apenas um estudo de carácter preliminar. É ainda imprescindível realizar estudos exaustivos sobre as implicações que a idade e o tempo de armazenamento dos RBC podem ter na sobrevivência e proliferação de células T, provavelmente responsáveis pelos inesperados resultados obtidos neste estudo.
As discrasias sanguíneas são patologias associadas a alterações funcionais ou estruturais de um qualquer constituinte do sangue. A Policitemia Vera (PV) e a Policitemia Secundária (SP), inseridas neste grupo, são doenças associadas com o aumento da quantidade de eritrócitos (eritrocitose) na corrente sanguínea. O aumento da quantidade de glóbulos vermelhos (RBC) na PV parece estar maioritariamente associado à presença de uma mutação na cinase Janus 2 (JAK2) que culmina na ativação constitutiva desta cinase nas células hematopoiéticas e consequente produção excessiva de RBC. Contrariamente à PV, a SP resulta de mecanismos que não envolvem alterações nas células progenitoras da medula óssea, estando maioritariamente associada à presença de outras patologias. Por sua vez, a Hemocromatose Hereditária (HH) e a Hemocromatose Secundária (SH) são doenças associadas ao aumento da quantidade de ferro e também elas são inseridas no grupo das discrasias sanguíneas. Enquanto a HH é uma doença associada a mutações no gene HFE ou a alterações nos mediadores envolvidos na absorção e transporte de ferro, a SH é uma patologia que surge maioritariamente como consequência da necessidade de transfusões sanguíneas recorrentes verificada em algumas doenças. Atualmente, e tendo em conta as evidências experimentais, pensa-se que os RBC estão envolvidos em várias funções para além do transporte de gases metabólicos e nutrientes para os tecidos. De facto, a presença de RBC em culturas com linfócitos humanos isolados do sangue periférico e estimulados com mitogénios é responsável pelo aumento da proliferação e sobrevivência de linfócitos T. Nos poucos estudos prévios onde foram estudadas populações de linfócitos em doentes com PV e SP, foi descrito um aumento do rácio CD4+/CD8+, assim como um aumento da percentagem e da capacidade supressora de linfócitos T CD4+ reguladores (CD4+CD25+FoxP3+) no sangue periférico de doentes com PV. A nível da HH e da SH, o panorama é distinto, tendo sido realizados estudos imunológicos com maior frequência, sendo que a maioria reporta anomalias a nível das populações de linfócitos T CD8+, incluindo a diminuição da população T CD8+ e o aumento da percentagem de células CD8+CD28-. O objetivo primordial deste trabalho foi avaliar se doentes com anomalias no número de RBC apresentavam alterações fenotípicas e funcionais a nível das diferentes populações de linfócitos e se estas alterações poderiam ser influenciadas pelo tratamento com flebotomias. Para isso, foi realizado o estudo fenotípico das populações de linfócitos em doentes com PV, SP, HH e SH, assim como num grupo controlo constituído por dadores regulares de sangue. Para além disso, foi também avaliada a influência da presença de RBC de doentes e controlos na proliferação e sobrevivência de linfócitos T, recorrendo à realização de culturas com células mononucleares do sangue periférico (PBMC). As PBMC usadas neste estudo foram isoladas a partir de amostras de sangue periférico de dezanove dadores saudáveis, dezassete doentes com HH, três doentes com SH, três doentes com PV e dez doentes com SP. As percentagens de populações de linfócitos, assim como a percentagem de proliferação e sobrevivência das células em cultura foram determinadas através da análise por citómetria de fluxo. Várias condições de cultura foram incluídas neste estudo, mais especificamente a estimulação das células com um mitogénio de linfócitos T ou a presença de RBC autólogos ou heterólogos. Quando as percentagens das diferentes populações de linfócitos foram analisadas, foi possível observar que a percentagem de linfócitos NK se encontrava elevada em todos os grupos de doentes em comparação ao grupo de indivíduos saudáveis, no entanto este aumento só era estatisticamente significativo nos grupos de doentes com HH e SP. Em contraste, a percentagem de linfócitos B encontrava-se significativamente diminuída nos doentes com HH, PV e SP em relação ao grupo controlo. Outras diferenças, nomeadamente o aumento das populações de linfócito T CD8+ e CD8+CD28+ nos doentes com SH e SP, assim como a diminuição destas populações em doentes com PV, foram também observadas. Em relação à monotorização das percentagens de linfócitos dos doentes ao longo do tratamento com flebotomias, foi verificada uma tendência para a diminuição da percentagem de linfócitos NK em cinco dos sete doentes seguidos. Em relação à influência dos RBC nas culturas de PBMC, apenas ligeiras diferenças em termos de proliferação e sobrevivência foram observadas, com a excepção das culturas com PBMC de doentes com PV onde, de modo geral, se registou uma menor percentagem de proliferação em todas as condições de cultura em comparação com os restantes grupos de doentes e com o grupo controlo, provavelmente devido ao aumento da população de linfócitos T CD4+ reguladores no sangue periférico descrito recentemente em doentes com PV. No entanto, e talvez uma das mais inesperadas observações relativa às experiências de proliferação, foi o facto de ser constantemente verificado que os próprios RBC, principalmente os RBC isolados de dadores saudáveis, eram capazes de induzir proliferação de uma população de linfócitos T na ausência de estímulo e sem a observação do aumento de tamanho e complexidade desta população (blastos), independentemente da origem dos PBMC onde eram adicionados. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que o excesso de RBC, bem como o excesso de ferro em circulação, podem estar associados com alterações a nível dos linfócitos NK e B. Futuramente, é necessário realizar mais estudos com vista a determinar se para além das alterações a nível da quantidade de linfócitos NK e B associadas às discrasias sanguíneas, também se encontram anomalias noutros parâmetros destas populações, como por exemplo na expressão de recetores superficiais. Existe também a necessidade de alargar o período de monotorização dos doentes tratados com flebotomias, assim como a necessidade de aumentar o número de indivíduos estudados, tendo em conta que este foi apenas um estudo de carácter preliminar. É ainda imprescindível realizar estudos exaustivos sobre as implicações que a idade e o tempo de armazenamento dos RBC podem ter na sobrevivência e proliferação de células T, provavelmente responsáveis pelos inesperados resultados obtidos neste estudo.
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Glóbulos Vermelhos Hemocromatose Linfócitos Policitemia