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From Hypoxia to Healing: Optimizing Stem Cell Therapy for Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury
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| Documento em Acesso Embargado até dia 13-01-2029. Tente solicitar cópia ao autor carregando no ficheiro | 20.41 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), caused by oxygen and blood flow deprivation to the neonatal brain, is a leading cause of mortality and long-term neurological disabilities in children under five. Its complex pathophysiology— comprising excitotoxicity, inflammation, oxidative stress, and delayed cell death—poses significant therapeutic challenges. Moreover, current management with therapeutic hypothermia (TH) shows limited efficacy, particularly in severe cases, and excludes many neonates due to strict enrollment criteria. To overcome these limitations, preclinical research has explored stem cell therapies (SCT), particularly using stem cells from umbilical cord blood (UCB) and tissue (UC). These therapies show promise in reducing brain injury and improving outcomes, but challenges remain in optimizing doses, delivery methods, and scalability. Building on previous work, this thesis evaluated several approaches to optimize SCT for neonatal HIE. First, administration of UCBCs alone and in combination with TH in a rat model of HIE, reduced brain lesion size and improved functional outcomes more effectively than TH alone, while also reducing glial reactivity—an effect not observed with TH alone. These findings establish UCBCs as a potential therapy, particularly when TH is unavailable or insufficient. Nonetheless, the use of these cells can present disadvantages: autologous use, limited culture and expansion, thus not being possible to manipulate with preconditioning strategies. Thus, we focused on the use of UC-derived MSCs that overcome some of the limitations previously mentioned. Also, since preconditioning strategies are being explored as ways to potentiate MSCs therapeutic effects, we hypothesized that hypoxic preconditioning could enhance UC-MSC efficacy and what explored the potential mechanisms behind neurological recovery. Proteomic analysis revealed that HIE rats treated with hypoxiapreconditioned MSCs had an enrichment of pathways related to synapse function, brain connectivity, and energy metabolism. Moreover, administration of UC-MSCs preconditioned with short hypoxia induced a greater functional recovery in HIE rats than administration of UC-MSCs preconditioned mild hypoxia. Stem cell therapy requires high doses of stem cells, which limits its clinical translatability. To optimize SCT and significantly reduce effective doses of MSCs, we evaluated the impact of two delivery methods and the combination of different strategies on the efficacy of UC-MSCs. Intranasal administration of UC-MSCs was more effective in reducing the infarct volume enhancing motor and cognitive recovery than intravenous administration, restoring myelination in the corpus callosum, and mitigating glial reactivity. Intranasal administration of half the dose of hypoxia-preconditioned UCMSCs reduced neurological deficits associated with neonatal HIE. Strikingly, intranasal administration of secretome from hypoxia-preconditioned MSCs demonstrated similar therapeutic efficacy, offering a promising cell-free alternative. Finally, to address the limitations associated with the expansion of UC-MSCs and donor variability on the therapeutic potency of these cells, we aimed to determine if induced pluripotent stem cell-derived MSCs (iMSCs) could hold the same potential in the neonatal HIE model. Intranasal administration of iMSCs or their secretome improved motor and cognitive recovery, reduced brain lesion size, modulated glial reactivity, and enhanced neurogenesis in the hippocampus of HIE rats. The comparable outcomes between iMSCs and their secretome underscore the critical role of secreted factors, presenting a scalable, cell-free option for clinical application. In summary, this thesis advances the field of regenerative medicine for neonatal HIE by identifying innovative strategies to optimize stem cell therapies. The findings demonstrate the potential of intranasal delivery and hypoxic preconditioning to reduce the required cell doses while maintaining efficacy, making these therapies more feasible for clinical use. Furthermore, secretome-based approaches offer a scalable alternative that addresses logistical challenges. Beyond neonatal HIE, these strategies may have broader implications for other neurodevelopmental and neurological disorders, as well as for veterinary medicine. While significant progress has been made, future research should aim to elucidate the mechanisms underlying MSC and secretome efficacy and advance these approaches toward clinical trials, paving the way for innovations in regenerative medicine.
Encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal (EHI) é uma condição neurológica grave que resulta da privação de oxigénio e fluxo sanguíneo no cérebro neonatal. Esta condição é a segunda causa mais frequente de mortalidade e deficiências neurológicas de longo termo em crianças com menos de 5 anos. A fisiopatologia da EHI neonatal envolve mecanismos complexos, nomeadamente excitotoxicidade, inflamação, stress oxidativo e morte celular por apoptose, o que cria desafios significativos para o seu tratamento. Atualmente, o tratamento clínico baseia-se na hipotermia terapêutica (HT), que demonstrou eficácia limitada, especialmente em casos graves, sendo que os critérios rigorosos de inclusão excluem um número significativo de recém-nascidos com EHI. Para ultrapassar estas limitações, a investigação pré-clínica tem-se focado em estratégias alternativas, como as terapias com células estaminais (TCE). Vários estudos têm demonstrado o potencial do uso de células estaminais derivadas de fontes como o sangue do cordão umbilical (SCU) e o tecido do cordão umbilical (TCU) em mitigar lesões cerebrais e melhorar as funções neurológicas em modelos animais de EHI. Contudo, a transposição das TCE para a prática clínica requer ainda otimizar doses terapêuticas, aperfeiçoar os métodos de administração e garantir a escalabilidade destas terapias para que sejam economicamente viáveis. O primeiro capítulo desta tese revê os últimos avanços feitos na área da EHI, começando por apresentar uma visão abrangente da fisiopatologia e dos modelos de EHI, bem como as estratégias terapêuticas emergentes para o tratamento da EHI neonatal. Este capítulo integra também duas revisões sistemáticas. A primeira reúne dados de 58 estudos préclínicos em modelos de EHI neonatal, que utilizaram células estaminais derivadas de SCU, TCU, placenta e medula óssea. Cerca de 80% destes estudos relataram melhorias nas funções cognitivas e motoras dos animais lesados, apoiando o potencial de TCE como alternativa ou complemento à HT. A segunda revisão centrou-se em estratégias de précondicionamento de células estaminais mesenquimais (MSCs) para melhorar o seu potencial terapêutico em lesões agudas do sistema nervoso. Os 52 estudos incluídos exploraram nove tipos de pré-condicionamento, como manipulação da pressão de oxigénio, exposição a substâncias químicas, mediadores de lesão ou fatores inflamatórios, uso de ultrassom, campos magnéticos ou forças biomecânicas, e culturas celulares 3D ou em scaffolds. A maioria destas estratégias resultou num aumento da sobrevivência e migração das MSCs, bem como alterou o seu proteoma e secretoma. A administração de MSCs pré-condicionadas promoveu ainda a neuroreparação, neuroproteção e recuperação funcional em modelos de lesões neurológicas agudas em roedores, sem serem reportados efeitos adversos. Assim, tendo por base a evidência existente, os objetivos desta tese incluem: • Avaliar o potencial terapêutico das células do SCU e a sua combinação com hipotermia (Capítulo 4). • Explorar os efeitos de diferentes regimes de pré-condicionamento por hipóxia (hipóxia moderada prolongada versus hipóxia severa curta) no potencial terapêutico das MSCs-TCU e identificar os mecanismos moleculares modulados a longo-prazo nos animais lesados e tratados com as células (Capítulo 5). • Verificar se a via intranasal é superior à intravenosa para a administração de MSCs-TCU e determinar se a administração intranasal de MSCs-TCU precondicionadas por hipoxia e do seu secretoma se traduzem em abordagens com maior eficiência em reduzir défices neurológicos associados com o EHI neonatal (Capítulo 6). • Avaliar a eficácia de MSCs derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (iMSCs) e do seu secretoma na promoção da reparação e recuperação neurocognitiva em ratos que mimetizam EHI neonatal (Capítulo 7). No capítulo 4 a administração de células do SCU foi avaliada isoladamente e em combinação com hipotermia num modelo de EHI neonatal em roedores. As lesões hipóxico-isquémicas cerebrais foram induzidas em ratos Wistar Han ao 10.º dia de vida, seguidas de quatro horas de hipotermia e administração intravenosa de células do SCU 24, 48 e 72 horas após a lesão cerebral. Os resultados revelaram que a administração de células do SCU reduziu o tamanho da lesão cerebral, melhorando as funções motoras e cognitivas dos animais de forma mais eficaz do que a hipotermia isolada. A administração destas células também reduziu a reatividade glial, o que não foi observado em animais tratados com hipotermia apenas. Estes resultados destacam o SCU como uma opção terapêutica, especialmente em situações em que a hipotermia não está disponível ou é insuficiente. No entanto, o uso do SCU apresenta algumas desvantagens: o seu uso autólogo limita a aplicação em situações clínicas, e este produto é difícil de colocar em cultura celular, expandir e manipular com estratégias de precondicionamento. O capítulo 5 aborda o pré-condicionamento por hipóxia como estratégia para potenciar as MSCs-TCU, investigando também os mecanismos induzidos pela administração destas células. Em primeiro lugar foram comparados os efeitos da hipóxia moderada prolongada (5% de oxigénio por 48 horas) e da hipóxia severa curta (0,1% de oxigénio por 24 horas) na eficácia das MSCs-TCU em reduzir os défices num modelo de EHI em roedores. O pré-condicionamento com hipóxia severa curta resultou numa recuperação funcional maior e em défices motores e cognitivos reduzidos em comparação com a hipóxia moderada prolongada. De seguida, as análises proteómicas revelaram que os animais tratados com MSCs pré-condicionadas por hipóxia mostraram um enriquecimento significativo de vias relacionadas com a conectividade sináptica e cerebral, bem como o metabolismo energético. O capítulo 6 explora o impacto da via de administração na eficácia das terapias com células estaminais e a combinação de diversas estratégias para otimizar TCE à base de MSCs-TCU. Primeiro, foram comparadas as administrações intranasal e intravenosa de MSCs-TCU numa dose mais reduzida (50.000 células) no mesmo modelo de EHI neonatal. A administração intranasal demonstrou ter uma eficiência superior nesta dose, reduzindo o volume de lesão cerebral e os défices associados a uma lesão hipóxicoisquémica, restaurando a mielinização no corpo caloso e mitigando a reatividade glial de forma mais eficaz. Adicionalmente, com a combinação da administração intranasal e do uso de MSCs-TCU precondicionadas por hipoxia foi possível obter a mesma recuperação funcional dos animais, mesmo quando utilizada metade da dose. Além disso, o secretoma das MSCs pré-condicionadas por hipóxia severa curta demonstrou eficácia terapêutica semelhante à das MSCs-TCU precondicionadas, indicando uma alternativa acelular para promover a reparação neurológica. Estas estratégias também promoveram a redução da reatividade glial, com menor número de astrócitos e microglias num estado próinflamatório. Estes resultados apoiam a administração intranasal de MSCs-TCU precondicionadas com hipoxia como um método minimamente invasivo e eficaz, alcançando benefícios terapêuticos significativos mesmo reduzindo a dose celular administrada. As iMSCs oferecem propriedades consistentes que respondem aos desafios de escalabilidade das MSCs tradicionais. Assim, no capítulo 7, foi avaliada a eficácia da administração intranasal das iMSCs ou do seu secretoma no mesmo modelo de EHI neonatal. Tanto as iMSCs como o secretoma produziram melhorias significativas nas funções motoras e cognitivas, redução do tamanho da lesão cerebral e aumento da neurogénese. Adicionalmente, a reatividade glial foi substancialmente mitigada, criando um ambiente mais favorável para a neuroreparação. Adicionalmente, os resultados comparáveis entre iMSCs e secretoma destacam o papel crítico dos fatores secretados por estas células na reparação neurológica. Os resultados apresentados nesta tese contribuem para o avanço da medicina regenerativa na EHI neonatal, ao identificar estratégias inovadoras para otimizar as terapias com células estaminais. A administração intranasal e o pré-condicionamento por hipoxia são estratégias que permitiram reduzir as doses celulares necessárias, sem comprometer a viabilidade e eficácia da terapia. Por outro lado, os resultados obtidos com as terapias baseadas no secretoma das células estaminais (precondicionadas e iMSCs) suporta o uso desta abordagem como uma alternativa escalável, capaz de contornar os desafios logísticos em aplicações clínicas das TCEs. Adicionalmente, estas estratégias podem ser transpostas para o tratamento de outras doenças isquémicas ou do neurodesenvolvimento, bem como aplicações veterinárias, aumentando o impacto desta investigação. Apesar dos progressos alcançados, estudos futuros deverão focar-se em identificar os mecanismos responsáveis pela eficácia das MSCs e do secretoma, bem como em progredir estas estratégias inovadoras, como o pré-condicionamento e a administração de iMSCs, para ensaios clínicos. Assim, as terapias baseadas em células estaminais podem revolucionar o tratamento da EHI neonatal, melhorando os desfechos destes recém-nascidos em todo o mundo.
Encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal (EHI) é uma condição neurológica grave que resulta da privação de oxigénio e fluxo sanguíneo no cérebro neonatal. Esta condição é a segunda causa mais frequente de mortalidade e deficiências neurológicas de longo termo em crianças com menos de 5 anos. A fisiopatologia da EHI neonatal envolve mecanismos complexos, nomeadamente excitotoxicidade, inflamação, stress oxidativo e morte celular por apoptose, o que cria desafios significativos para o seu tratamento. Atualmente, o tratamento clínico baseia-se na hipotermia terapêutica (HT), que demonstrou eficácia limitada, especialmente em casos graves, sendo que os critérios rigorosos de inclusão excluem um número significativo de recém-nascidos com EHI. Para ultrapassar estas limitações, a investigação pré-clínica tem-se focado em estratégias alternativas, como as terapias com células estaminais (TCE). Vários estudos têm demonstrado o potencial do uso de células estaminais derivadas de fontes como o sangue do cordão umbilical (SCU) e o tecido do cordão umbilical (TCU) em mitigar lesões cerebrais e melhorar as funções neurológicas em modelos animais de EHI. Contudo, a transposição das TCE para a prática clínica requer ainda otimizar doses terapêuticas, aperfeiçoar os métodos de administração e garantir a escalabilidade destas terapias para que sejam economicamente viáveis. O primeiro capítulo desta tese revê os últimos avanços feitos na área da EHI, começando por apresentar uma visão abrangente da fisiopatologia e dos modelos de EHI, bem como as estratégias terapêuticas emergentes para o tratamento da EHI neonatal. Este capítulo integra também duas revisões sistemáticas. A primeira reúne dados de 58 estudos préclínicos em modelos de EHI neonatal, que utilizaram células estaminais derivadas de SCU, TCU, placenta e medula óssea. Cerca de 80% destes estudos relataram melhorias nas funções cognitivas e motoras dos animais lesados, apoiando o potencial de TCE como alternativa ou complemento à HT. A segunda revisão centrou-se em estratégias de précondicionamento de células estaminais mesenquimais (MSCs) para melhorar o seu potencial terapêutico em lesões agudas do sistema nervoso. Os 52 estudos incluídos exploraram nove tipos de pré-condicionamento, como manipulação da pressão de oxigénio, exposição a substâncias químicas, mediadores de lesão ou fatores inflamatórios, uso de ultrassom, campos magnéticos ou forças biomecânicas, e culturas celulares 3D ou em scaffolds. A maioria destas estratégias resultou num aumento da sobrevivência e migração das MSCs, bem como alterou o seu proteoma e secretoma. A administração de MSCs pré-condicionadas promoveu ainda a neuroreparação, neuroproteção e recuperação funcional em modelos de lesões neurológicas agudas em roedores, sem serem reportados efeitos adversos. Assim, tendo por base a evidência existente, os objetivos desta tese incluem: • Avaliar o potencial terapêutico das células do SCU e a sua combinação com hipotermia (Capítulo 4). • Explorar os efeitos de diferentes regimes de pré-condicionamento por hipóxia (hipóxia moderada prolongada versus hipóxia severa curta) no potencial terapêutico das MSCs-TCU e identificar os mecanismos moleculares modulados a longo-prazo nos animais lesados e tratados com as células (Capítulo 5). • Verificar se a via intranasal é superior à intravenosa para a administração de MSCs-TCU e determinar se a administração intranasal de MSCs-TCU precondicionadas por hipoxia e do seu secretoma se traduzem em abordagens com maior eficiência em reduzir défices neurológicos associados com o EHI neonatal (Capítulo 6). • Avaliar a eficácia de MSCs derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (iMSCs) e do seu secretoma na promoção da reparação e recuperação neurocognitiva em ratos que mimetizam EHI neonatal (Capítulo 7). No capítulo 4 a administração de células do SCU foi avaliada isoladamente e em combinação com hipotermia num modelo de EHI neonatal em roedores. As lesões hipóxico-isquémicas cerebrais foram induzidas em ratos Wistar Han ao 10.º dia de vida, seguidas de quatro horas de hipotermia e administração intravenosa de células do SCU 24, 48 e 72 horas após a lesão cerebral. Os resultados revelaram que a administração de células do SCU reduziu o tamanho da lesão cerebral, melhorando as funções motoras e cognitivas dos animais de forma mais eficaz do que a hipotermia isolada. A administração destas células também reduziu a reatividade glial, o que não foi observado em animais tratados com hipotermia apenas. Estes resultados destacam o SCU como uma opção terapêutica, especialmente em situações em que a hipotermia não está disponível ou é insuficiente. No entanto, o uso do SCU apresenta algumas desvantagens: o seu uso autólogo limita a aplicação em situações clínicas, e este produto é difícil de colocar em cultura celular, expandir e manipular com estratégias de precondicionamento. O capítulo 5 aborda o pré-condicionamento por hipóxia como estratégia para potenciar as MSCs-TCU, investigando também os mecanismos induzidos pela administração destas células. Em primeiro lugar foram comparados os efeitos da hipóxia moderada prolongada (5% de oxigénio por 48 horas) e da hipóxia severa curta (0,1% de oxigénio por 24 horas) na eficácia das MSCs-TCU em reduzir os défices num modelo de EHI em roedores. O pré-condicionamento com hipóxia severa curta resultou numa recuperação funcional maior e em défices motores e cognitivos reduzidos em comparação com a hipóxia moderada prolongada. De seguida, as análises proteómicas revelaram que os animais tratados com MSCs pré-condicionadas por hipóxia mostraram um enriquecimento significativo de vias relacionadas com a conectividade sináptica e cerebral, bem como o metabolismo energético. O capítulo 6 explora o impacto da via de administração na eficácia das terapias com células estaminais e a combinação de diversas estratégias para otimizar TCE à base de MSCs-TCU. Primeiro, foram comparadas as administrações intranasal e intravenosa de MSCs-TCU numa dose mais reduzida (50.000 células) no mesmo modelo de EHI neonatal. A administração intranasal demonstrou ter uma eficiência superior nesta dose, reduzindo o volume de lesão cerebral e os défices associados a uma lesão hipóxicoisquémica, restaurando a mielinização no corpo caloso e mitigando a reatividade glial de forma mais eficaz. Adicionalmente, com a combinação da administração intranasal e do uso de MSCs-TCU precondicionadas por hipoxia foi possível obter a mesma recuperação funcional dos animais, mesmo quando utilizada metade da dose. Além disso, o secretoma das MSCs pré-condicionadas por hipóxia severa curta demonstrou eficácia terapêutica semelhante à das MSCs-TCU precondicionadas, indicando uma alternativa acelular para promover a reparação neurológica. Estas estratégias também promoveram a redução da reatividade glial, com menor número de astrócitos e microglias num estado próinflamatório. Estes resultados apoiam a administração intranasal de MSCs-TCU precondicionadas com hipoxia como um método minimamente invasivo e eficaz, alcançando benefícios terapêuticos significativos mesmo reduzindo a dose celular administrada. As iMSCs oferecem propriedades consistentes que respondem aos desafios de escalabilidade das MSCs tradicionais. Assim, no capítulo 7, foi avaliada a eficácia da administração intranasal das iMSCs ou do seu secretoma no mesmo modelo de EHI neonatal. Tanto as iMSCs como o secretoma produziram melhorias significativas nas funções motoras e cognitivas, redução do tamanho da lesão cerebral e aumento da neurogénese. Adicionalmente, a reatividade glial foi substancialmente mitigada, criando um ambiente mais favorável para a neuroreparação. Adicionalmente, os resultados comparáveis entre iMSCs e secretoma destacam o papel crítico dos fatores secretados por estas células na reparação neurológica. Os resultados apresentados nesta tese contribuem para o avanço da medicina regenerativa na EHI neonatal, ao identificar estratégias inovadoras para otimizar as terapias com células estaminais. A administração intranasal e o pré-condicionamento por hipoxia são estratégias que permitiram reduzir as doses celulares necessárias, sem comprometer a viabilidade e eficácia da terapia. Por outro lado, os resultados obtidos com as terapias baseadas no secretoma das células estaminais (precondicionadas e iMSCs) suporta o uso desta abordagem como uma alternativa escalável, capaz de contornar os desafios logísticos em aplicações clínicas das TCEs. Adicionalmente, estas estratégias podem ser transpostas para o tratamento de outras doenças isquémicas ou do neurodesenvolvimento, bem como aplicações veterinárias, aumentando o impacto desta investigação. Apesar dos progressos alcançados, estudos futuros deverão focar-se em identificar os mecanismos responsáveis pela eficácia das MSCs e do secretoma, bem como em progredir estas estratégias inovadoras, como o pré-condicionamento e a administração de iMSCs, para ensaios clínicos. Assim, as terapias baseadas em células estaminais podem revolucionar o tratamento da EHI neonatal, melhorando os desfechos destes recém-nascidos em todo o mundo.
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Encefalopatia EHI Terapia Células Estaminais Hipotermia Pré-Clinico Hipóxia Précondicionamento MSCs iMSCs Isquémia Neonatal Asfixia Intranasal Encephalopathy stem Cell Therapy Hypothermia Preclinical Hypoxia Preconditioning Ischemia Asphyxia