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Authors
Abstract(s)
Cancer is a major global health problem, accounting for more than 8 million deaths/year
worldwide. In particular, cervical cancer is the 3rd most common malignancy and 4th cause of
death among women globally, being a persistent High Risk-HPV infection the main factor for
cervical cancer development. E6 and E7 HPV oncoproteins are responsible for cancer
development by degrading and inhibiting p53 and pRb tumour suppressor proteins,
respectively. Moreover, microRNAs (miRs) have been found to regulate tumorigenesis. In fact,
miR-375 has the ability to silence HPV E6 and E7 oncoproteins. Gene therapy is a promising
strategy to treat acquired diseases and/or genetic disorders, aiming to deliver genetic
material into target cells or tissue, expressing it to induce a therapeutic effect. Minicircle
DNA (mcDNA) is a new biopharmaceutical product only composed by the eukaryotic
transcription unit, improving its safety and therapeutic effect, obtained through
intramolecular recombination of the parental plasmid.
Thus, this work aims to produce and purify a mcDNA vector encoding primiR-375 and p53
genes to silence E6 and E7 oncoproteins and re-establish p53 and pRb tumour suppressor
levels on cervical cancer cells.
The purification of mcDNA vectors was performed using size exclusion chromatography
sepharose columns (Sephacryl S-1000 SF), showing that for the smallest vector, mcDNAprimiR-375, a 106 mL column allowed the efficient recovery of chromatographic fractions
composed only with mcDNA. On the other hand, for the biggest mcDNA vectors, it was
necessary to exploit the parameters affecting the sample molecules separation, choosing to
use a column with 180 mL of volume, allowing, similarly to the mcDNA-primiR-375
purification, recover fraction only composed with mcDNA. Simultaneously, cytotoxicity assays
on human fibroblasts and CaSki cells were performed, confirming that none of the vectors
were toxic to the fibroblasts and the mcDNA primiR-375+p53 presented the lower cell viability
for CaSki cells. In addition, the proliferation assay results performed on CaSki cells show that
number of viable cells decreases for the mcDNA vectors transfected cells, corroborating the
cytotoxicity assays results for this cell line. Western-Blot confirmed the re-establishment of
tumour suppressor proteins levels after 48h of transfection using mcDNA-p53 and mcDNAprimiR-375+p53.
Overall, these results suggest that the use of DNA vectors encoding for more than one
therapeutic gene, for example, the mcDNA-primiR-375+p53, allowed to achieve, on in vitro
assays, results suggesting a possible faster therapeutic action, thus demonstrating that they
may revolutionize their application in targeted therapies.
O cancro é um dos principais problemas de saúde, sendo responsável por mais de 8 milhões de mortes todos os anos, a nível mundial. O cancro do colo do útero é a 3ª malignidade mais frequente, sendo a 4ª causa de morte nas mulheres a nível mundial. A infeção persistente por HPV de alto risco é o fator principal para o desenvolvimento de cancro do colo do útero, dado que as oncoproteínas E6 e E7 são capazes de promover o desenvolvimento cancerígeno através da degradação e inibição das proteínas supressoras de tumor, p53 e pRb, respetivamente. A terapia génica é uma estratégia promissora no tratamento de doenças adquiridas e/ou desordens genéticas, tendo como objetivo a entrega de material genético em células ou tecidos alvo, de forma a induzir um efeito terapêutico. O DNA minicircular (mcDNA) é um novo produto biofarmacêutico, que se caracteriza por ser apenas constituído pela unidade de transcrição eucariota, aumentando a sua segurança e efeito terapêutico, sendo obtido através da recombinação intramolecular do plasmídeo parental. Além disso, tem-se atribuído aos microRNAs (miRs) um papel regulador da carcinogénese, por exemplo, está descrito que o miR-375 possui a capacidade de silenciar as oncoproteínas E6 e E7. Desta forma, este trabalho tem como objetivo a produção e purificação de vetores de mcDNA que codifiquem para os genes primiR-375 e p53, de forma a silenciar as oncoproteínas E6 e E7 e reestabelecer os níveis das proteínas supressoras de tumor p53 e pRb nas células do cancro do colo do útero. A purificação dos vetores de mcDNA foi efetuada utilizando colunas de sefarose (Sephacryl S1000 SF) de cromatografia de exclusão molecular, demonstrando que para o vetor de tamanho mais pequeno, mcDNA-primiR-375, uma coluna de 106 mL permitiu uma recuperação eficiente de frações cromatográficas compostas apenas por mcDNA. No entanto, para os vetores de maior tamanho, mcDNA-p53 e mcDNA-primiR-375+p53, foi necessário explorar os parâmetros que afetam a separação das moléculas das amostras a purificar, optando-se por utilizar uma coluna com o volume de 180 mL, permitindo assim, à semelhança do mcDNA-primiR-375, recuperar frações compostas apenas por mcDNA. Paralelamente foram realizados ensaios de citotoxicidade em fibroblastos humanos e células CaSki, revelando que nenhum dos vetores é tóxico nos fibroblastos humanos e que o mcDNA-primiR-375+p53 apresentou a menor viabilidade celular em células CaSki. Para além disso, os resultados do ensaio de proliferação realizado em células CaSki demonstraram que o número de células viáveis diminui nas células transfectadas com os vetores de DNA, corroborando os ensaios de citotoxicidade realizados nesta mesma linha celular cancerígena. A realização do ensaio de Western-Blot confirmou o restabelecimento dos níveis da proteína supressora de tumor p53 após 48 horas de transfecção com mcDNA-p53 e mcDNA-primiR-375+p53 em células CaSki. Os resultados obtidos nos em ensaios in vitro desenvolvidos neste trabalho, sugerem que o uso de vetores de DNA que codifiquem para mais do que um gene com finalidade terapêutica, como é exemplo o mcDNA-primiR-375+p53, permitiram observar efeitos mais significativos, sugerindo assim que este tipo de vetores podem ter uma ação terapêutica mais eficiente.
O cancro é um dos principais problemas de saúde, sendo responsável por mais de 8 milhões de mortes todos os anos, a nível mundial. O cancro do colo do útero é a 3ª malignidade mais frequente, sendo a 4ª causa de morte nas mulheres a nível mundial. A infeção persistente por HPV de alto risco é o fator principal para o desenvolvimento de cancro do colo do útero, dado que as oncoproteínas E6 e E7 são capazes de promover o desenvolvimento cancerígeno através da degradação e inibição das proteínas supressoras de tumor, p53 e pRb, respetivamente. A terapia génica é uma estratégia promissora no tratamento de doenças adquiridas e/ou desordens genéticas, tendo como objetivo a entrega de material genético em células ou tecidos alvo, de forma a induzir um efeito terapêutico. O DNA minicircular (mcDNA) é um novo produto biofarmacêutico, que se caracteriza por ser apenas constituído pela unidade de transcrição eucariota, aumentando a sua segurança e efeito terapêutico, sendo obtido através da recombinação intramolecular do plasmídeo parental. Além disso, tem-se atribuído aos microRNAs (miRs) um papel regulador da carcinogénese, por exemplo, está descrito que o miR-375 possui a capacidade de silenciar as oncoproteínas E6 e E7. Desta forma, este trabalho tem como objetivo a produção e purificação de vetores de mcDNA que codifiquem para os genes primiR-375 e p53, de forma a silenciar as oncoproteínas E6 e E7 e reestabelecer os níveis das proteínas supressoras de tumor p53 e pRb nas células do cancro do colo do útero. A purificação dos vetores de mcDNA foi efetuada utilizando colunas de sefarose (Sephacryl S1000 SF) de cromatografia de exclusão molecular, demonstrando que para o vetor de tamanho mais pequeno, mcDNA-primiR-375, uma coluna de 106 mL permitiu uma recuperação eficiente de frações cromatográficas compostas apenas por mcDNA. No entanto, para os vetores de maior tamanho, mcDNA-p53 e mcDNA-primiR-375+p53, foi necessário explorar os parâmetros que afetam a separação das moléculas das amostras a purificar, optando-se por utilizar uma coluna com o volume de 180 mL, permitindo assim, à semelhança do mcDNA-primiR-375, recuperar frações compostas apenas por mcDNA. Paralelamente foram realizados ensaios de citotoxicidade em fibroblastos humanos e células CaSki, revelando que nenhum dos vetores é tóxico nos fibroblastos humanos e que o mcDNA-primiR-375+p53 apresentou a menor viabilidade celular em células CaSki. Para além disso, os resultados do ensaio de proliferação realizado em células CaSki demonstraram que o número de células viáveis diminui nas células transfectadas com os vetores de DNA, corroborando os ensaios de citotoxicidade realizados nesta mesma linha celular cancerígena. A realização do ensaio de Western-Blot confirmou o restabelecimento dos níveis da proteína supressora de tumor p53 após 48 horas de transfecção com mcDNA-p53 e mcDNA-primiR-375+p53 em células CaSki. Os resultados obtidos nos em ensaios in vitro desenvolvidos neste trabalho, sugerem que o uso de vetores de DNA que codifiquem para mais do que um gene com finalidade terapêutica, como é exemplo o mcDNA-primiR-375+p53, permitiram observar efeitos mais significativos, sugerindo assim que este tipo de vetores podem ter uma ação terapêutica mais eficiente.
Description
Keywords
Cervical Cancer Gene Therapy Minicircle Dna Mir-375 P53 Prb