Publication
Development of DNA nanovaccines based on functionalized RALA and Chitosan nanoparticles bearing HPV-16 oncogenes
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas::Ciências da Saúde | |
| datacite.subject.sdg | 03:Saúde de Qualidade | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Ângela Maria Almeida de | |
| dc.contributor.advisor | Eusébio, Dalinda Isabel da Silva | |
| dc.contributor.advisor | Cui, Zhengrong | |
| dc.contributor.author | Giusti, Andressa Moreira | |
| dc.date.accessioned | 2025-11-12T10:04:37Z | |
| dc.date.available | 2025-11-12T10:04:37Z | |
| dc.date.issued | 2025-10-03 | |
| dc.description.abstract | Cervical cancer (CC), a leading cause of cancer mortality among women, is mainly caused by persistent high-risk human papillomavirus infections, particularly HPV-16 and -18. These viruses possess the oncoproteins E6 and E7, which interfere with p53 and retinoblastoma protein (pRB), respectively, contributing to tumorigenesis. Current vaccines prevent infection but have no therapeutic effect. Moreover, the aggressiveness and lack of specificity of current treatments require innovative targeted therapeutics. DNA vaccines targeting the E6 and E7 oncogenes can be a safer and more promising option for CC eradication, providing preventive and therapeutic effects. The optimal DNA vaccine scenario includes the use of minicircle DNA (mcDNA), a safer and efficient vector than the conventional plasmid DNA (pDNA). So, in this study, we explored the complexation of mcDNA encoding one or both mutated HPV-16 oncogenes (E7mut or E6mut) with biocompatible materials, such as cellpenetrating peptides (CPPs) like RALA, and chitosan (CS). These delivery systems were functionalized with ligands of R8-mannose (R8M), which can enhance DNA delivery and targeting to antigen-presenting cells (APCs). Additionally, we investigated the powder conversion of the DNA/CS-based vaccine using thin-film freeze-drying (TFFD) to enhance vaccine stability. Pure mcDNA (2 µg) was used to optimize the amine-to-phosphate (N/P) ratios of RALA, with and without R8M, and nanoparticles (NPs) were characterized for size, polydispersity index (PDI), zeta potential, complexation efficiency (CE), stability, morphology, and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). In vitro studies assessed biocompatibility and gene expression in JAWSII dendritic cells after 24 h transfection. For CS-based systems, NPs were prepared with CS, sodium tripolyphosphate (TPP), and 2 µg of parental plasmid (PP)/pDNA or mcDNA encoding both genes, and R8M was also included. The same characterization and biocompatibility assays were performed. Powder conversion of CS NPs was done using TFFD, optimizing conditions for suitable and stable powders. For RALA-based NPs, a N/P ratio of 1.25 was optimal, resulting in homogeneous NPs under 150 nm, negative surface charge, and high CE (>97%). Their morphology was spherical/oval, and incorporation of components was confirmed by FTIR. The NPs were stable under cell culture conditions and biocompatible with JAWSII cells. Expression of the E6 gene was significantly higher in RALA-mannosylated systems, with no differences between the E6mut and multigenic vectors’ gene expression. For CS-based NPs, promising characteristics were obtained, with sizes under 120 nm, homogeneity, positive charges (>20 mV), and CE >98%. Incorporation of PP or mcDNA and R8M did not affect NP properties, indicating feasibility for formulation. The NPs exhibited spherical/oval morphology, and FTIR confirmed the presence of all components. The systems were stable under cell culture conditions and biocompatible with JAWSII cells. Powder conversion of CS-based NPs was optimized with sucrose (1% solid content) as a lyoprotectant, yielding the best results with 0.5 mL per vial. For scale-up with higher NP batches, a solid content of 5.05% with sucrose and leucine was optimal, where R8M incorporation and mcDNA usage showed consistent results, with no changes in NP properties after TFFD. The powders had porous, brittle matrices typical of TFFD. Stability tests over 14 days showed the best result of the powder vaccine at 4°C, supporting improved vaccine storage and distribution in low-resource settings. In conclusion, R8M functionalization enhanced cellular transfection and gene expression in RALA-based systems. Both peptide- and polymer-based delivery systems, with and without R8M, exhibited suitable physicochemical characteristics and biocompatibility. TFFD successfully converted liquid vaccines into stable powders while preserving NPs properties and producing highly porous powders with the potential for good aerosol properties. These findings support further studies exploring intranasal administration for cervical cancer immunization. | eng |
| dc.description.abstract | O cancro do colo do útero (CCU), uma das principais causas de mortalidade por cancro entre as mulheres, resulta maioritariamente de infecções persistentes pelo vírus do papiloma humano (HPV) de alto risco (hrHPV), particularmente os HPV-16 e -18. As oncoproteínas E6 e E7 destes vírus contribuem para a tumorogénese das células infetadas. A oncoproteína E6 vai induzir a degradação da p53 e interferir na apoptose, e a E7 vai afetar a proteína do retinoblastoma (pRB), levando à desregulação do ciclo celular e consequente proliferação celular descontrolada. Embora a prevenção por meio das vacinas profiláticas atuais contra o HPV seja fundamental, estas vacinas não têm qualquer efeito terapêutico quando o paciente já se encontra infetado. A deteção precoce do cancro melhora os resultados de tratamento, mas não é efetivamente implementada em países em desenvolvimento, contribuindo para alta incidência e mortalidade. Os tratamentos convencionais geralmente carecem de especificidade, causando efeitos colaterais significativos a nível sistémico, o que tem levado ao desenvolvimento das vacinas de DNA como alternativas mais seguras e eficazes. Vacinas de DNA que codifiquem os oncogenes E6 e E7 do HPV-16 podem ativar respostas imunes, mas o DNA plasmídico (pDNA) sozinho tem uma internalização celular limitada e pode desencadear reações adversas. O DNA minicircular (mcDNA) oferece uma solução promissora ao remover os genes bacterianos, enquanto que sistemas de entrega biocompatíveis baseados em quitosano (CS) e péptidos de penetração celular (CPPs) como o RALA, juntamente com a funcionalização com ligandos de R8-mannose (R8M), podem melhorar a entrega e o direcionamento do DNA para células apresentadoras de antigénios (APCs). Neste estudo, foi explorada a funcionalização de sistemas de entrega baseados em RALA e CS com R8M, para o transporte e entrega de vetores de DNA, codificando um ou ambos os oncogenes mutados do HPV-16 (E6mut e/ou E7mut). Além disso, foi investigada a conversão em pó da vacina baseada em DNA/CS usando a técnica de liofilização por filme fino (TFFD) para melhorar a estabilidade da vacina. Os vetores de pDNA e mcDNA codificando um ou dois genes foram produzidos numa estirpe de Escherichia coli geneticamente modificada, ZYCY10P3S2T, adequada para produção de mcDNA por recombinação plasmídica. Os vetores foram extraídos de pellets bacterianos e purificados por técnicas cromatográficas. O mcDNA puro (2 µg) foi utilizado para otimizar as proporções/rácios de amina versus fosfato (N/P) de RALA, com e sem R8M. Após a formulação de nanopartículas (NPs) estas foram caraterizadas avaliando o tamanho, índice de polidispersidade (PDI), potencial zeta, eficiência de complexação (EC), estabilidade, morfologia e composição por Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). Também foram realizados estudos in vitro para avaliar a biocompatibilidade, estabilidade e o nível de transcritos dos respetivos antigénios em células dendríticas JAWSII transfetadas com as NPs. Para sistemas de entrega baseados em CS, foi combinado este polímero com fosfato de trimetilamina (TPP) e 2 µg de PP ou mcDNA codificando ambos os genes, e o R8M também foi incluído. A mesma caracterização e os testes de biocompatibilidade realizados com as NPs de RALA foram realizados com as NPs de CS. As NPs de CS foram convertidas em pó usando o TFFD na Universidade do Texas em Austin, otimizando as condições para obtenção de um pó adequado e estável. A condição ótima para as NPs baseadas em RALA foi um rácio N/P de 1,25, resultando em NPs com tamanho inferior a 150 nm, distribuição homogênea, carga superficial negativa e alta EC (>97%). As NPs apresentaram morfologia esférica/oval, e o FTIR confirmou a incorporação de todos os componentes. As NPs mostraram-se estáveis sob condições de cultura celular, e os ensaios de citotoxicidade demonstraram sua biocompatibilidade com células JAWSII após 24 e 48 h de transfeção. A expressão do gene E6 foi maior nos sistemas manosilados, superando os sistemas não manosilados e os controlos. Não foram observadas diferenças entre os vetores de DNA E6mut e multigénicos, confirmando a eficácia das NPs baseadas em RALA para entrega direcionada às APCs, especialmente quando funcionalizadas com R8M. As NPs baseadas em CS mostraram características promissoras, com tamanho inferior a 120 nm, distribuição homogênea, cargas positivas (>20 mV) e EC >98%, sendo semelhantes quando complexadas com PP ou mcDNA, e com ou sem adição de R8M. As NPs apresentaram morfologia esférica/oval, e o FTIR confirmou a presença de todos os componentes. Os sistemas foram estáveis sob condições de cultura celular e biocompatíveis com as células JAWSII, confirmando serem adequados para entrega de vacinas. A conversão em pó das NPs PP/CS-TPP foi otimizada com sacarose (1% de teor sólido) como lio-protector, obtendo os melhores resultados com 0,5 mL por frasco. Para aumento de escala com maior lote de NPs, foram utilizados teores sólidos mais elevados (2,525% ou 5,05%), sendo 5,05% de sacarose o ideal. A leucina foi adicionada à formulação para melhorar o desempenho do aerosol e a estabilidade do pó. Nesta formulação final (5,05% sacarose + leucina) com uso de maior lote de NPs, a incorporação de R8M e o uso de mcDNA mostraram resultados consistentes, sem alterações nas propriedades das NPs após TFFD. Os pós apresentaram matrizes porosas e quebradiças típicas de pós obtidos por TFFD. Testes de estabilidade ao longo de 14 dias a -20°C, 4°C e 20°C mostraram a melhor estabilidade a 4°C para a vacina em pó, evidenciando uma mais valia dessa vacina ao requerer condições de armazenamento e distribuição mais económicas. Em conclusão, a funcionalização com R8M melhorou a transfeção celular e a expressão génica nos sistemas baseados em RALA. Ambos os sistemas de entrega baseados em péptidos e polímeros, com ou sem R8M, apresentaram características físico-químicas adequadas e biocompatibilidade. A técnica TFFD converteu com sucesso vacinas líquidas em pós estáveis, preservando as propriedades das NPs e produzindo pós altamente porosos, com potencial para boas propriedades de aerosol. Esses achados apoiam estudos adicionais sobre a administração intranasal para imunização contra o CCU. | por |
| dc.identifier.tid | 204036755 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/19208 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | |
| dc.subject | Cancro do colo do útero | |
| dc.subject | DNA minicircular | |
| dc.subject | Quitosano | |
| dc.subject | R8-mannose | |
| dc.subject | RALA | |
| dc.subject | TFFD | |
| dc.subject | Vacina de DNA | |
| dc.subject | Cervical cancer | |
| dc.subject | Chitosan | |
| dc.title | Development of DNA nanovaccines based on functionalized RALA and Chitosan nanoparticles bearing HPV-16 oncogenes | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| person.familyName | Giusti | |
| person.givenName | Andressa Moreira | |
| person.identifier.ciencia-id | 5015-72AE-E873 | |
| person.identifier.orcid | 0009-0004-3565-3340 | |
| relation.isAuthorOfPublication | fc5ad286-2c56-41a5-affd-49c7683bf162 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | fc5ad286-2c56-41a5-affd-49c7683bf162 | |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Ciências Biomédicas |
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