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Cancer gene therapy
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Ciências Químicas | por |
| dc.contributor.advisor | Costa, Diana Rita Barata | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Ângela Maria Almeida de | |
| dc.contributor.author | Neves, Ana Raquel Bastos | |
| dc.date.accessioned | 2020-03-18T17:03:05Z | |
| dc.date.available | 2020-06-23T00:30:14Z | |
| dc.date.issued | 2019-07-16 | |
| dc.date.submitted | 2019-06-24 | |
| dc.description.abstract | Cancer is one of the major causes of morbidity and mortality worldwide. It involves genetic changes that affect a variety of genes, namely tumour suppressor genes. The traditional approaches for cancer treatment include chemotherapy, surgery and radiation. Chemotherapy represents the main choice of treatment in most cases, however, traditional therapies seemed unvalued to fight against metastasis, recurrence of tumour, and the treatment of advanced cancer. Therefore, new strategies need to be developed to increase therapy efficacy. Gene therapy has brought a promising and unique approach to medicine because of its wide application in the treatment of various diseases, including hereditary diseases to acquired (infection or cancer) pathologies. p53 suppressor gene mutation or degradation is found in more than 50% of human cancers, therefore, gene therapy protocols focussed on the restauration of p53 protein are a priority in this field. For gene therapy viability in a clinical setting, the development of an efficient gene delivery system is imperative. The conception of delivery systems based on cell penetrating peptides represents an incredible asset and may deeply contribute for the evolution of cancer therapy. In this context, a new system for p53 encoding plasmid DNA (pDNA) delivery based on RALA peptide was designed and developed in order to produce a suitable intracellular delivery platform capable of gene delivery and restoration of p53 levels within the cancer cells. These carriers were characterized in terms of morphology, size, surface charge, loading and encapsulation efficiency and the fine structure was analyzed by Fourier-transformed infrared (FTIR) spectroscopy. The results showed that formed nanoparticles are suitable for cell uptake, internalization and gene release. Furthermore, stability studies demonstrated that RALA is capable of protect encapsulated DNA from serum nucleases and MTT assay showed that these systems are biocompatible. Confocal microscopy and live cell imaging experiments confirmed intracellular localization of nanoparticles, resulting in enhanced sustained pDNA uptake. Moreover, in vitro transfection of HeLa cells mediated by RALA/pDNA vectors allowed the detection of mRNA transcripts by RT-PCR and p53 protein expression by Western Blot. An ELISA kit assay quantified the produced protein levels. From these progresses, apoptosis in cancer cells was investigated. Caspase 3 activation was monitored by means of colorimetric assay and TUNEL assay enabled to confirm nuclear DNA fragmentation post transfection with the carriers. Lastly, a western blot assay with BAX antibody permitted to figure out which apoptosis pathway is responsible for cancer cells death. Taken together, the presented results revealed that the RALA/pDNA vector seems to be suitable as an innovative platform for p53 mediated cancer gene therapy. | eng |
| dc.description.abstract | O cancro é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Envolve mudanças genéticas que afetam uma variedade de genes, como os oncogenes e genes supressores de tumor. Esta alteração leva a uma proliferação celular desregulada, angiogénese, invasão e formação de metástases. As abordagens tradicionais para o tratamento do cancro incluem quimioterapia, cirurgia e radiação. A quimioterapia representa a principal escolha de tratamento na maioria dos casos, no entanto, as terapias tradicionais são ineficazes no combate de metástases, na recorrência do tumor e no tratamento do cancro num estado mais avançado. Em alguns casos estes tratamentos são ineficazes, inespecíficos, podem danificar células saudáveis, causar resistência a fármacos e serem acompanhados por efeitos secundários indesejáveis. Portanto, novas estratégias precisam de ser desenvolvidas de forma a aumentar a eficácia terapêutica. A terapia genética proporciona uma abordagem promissora e única à medicina devido à sua ampla aplicação no tratamento de várias doenças, incluindo doenças hereditárias e patologias adquiridas (infeção ou cancro). É uma técnica que usa ácidos nucleicos exógenos (DNA ou RNA) para reparar, substituir ou regular genes que expressem uma proteína terapêutica de interesse de forma a prevenir ou tratar uma doença. O gene supressor de tumor da proteína p53 é responsável por manter a integridade do genoma sobre situações de stress e está envolvido em várias vias celulares como a reparação do DNA, regulação do ciclo celular e indução da apoptose. No entanto, este gene encontra-se mutado ou inexistente em mais de 50 % dos cancros humanos, e, portanto, é fundamental criar protocolos de terapia génica que permitam restaurar o nível e função desta proteína. Para a terapia génica ser viável num cenário clínico é necessário desenvolver um sistema de entrega de genes eficiente. A conceção de sistemas de entrega baseados em péptidos capazes de penetrar nas células é vantajosa e pode contribuir para a evolução da terapia do cancro. Neste contexto, foi desenvolvido um novo sistema de entrega de DNA plasmídico (pDNA) codificante para a p53 com base no péptido RALA de modo a obter um sistema de entrega intracelular adequado e capaz de entregar o gene e restabelecer os níveis de p53 nas células cancerígenas. O péptido RALA é um péptido anfipático composto por 30 aminoácidos, com uma estrutura em hélice-a que possui baixa citotoxicidade. Este péptido quando conjugado com ácidos nucleicos estabelece interações eletrostáticas e forma partículas com tamanho nanométrico adequadas para a captação celular e internalização nuclear. No presente trabalho, estes transportadores foram, numa fase inicial, caracterizados em termos de morfologia, tamanho, carga superficial e eficiência de encapsulação por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e através da Dispersão da Luz Dinâmica (DLS) usando o Zetasizer Nano Zs., respetivamente, e a sua estrutura analisada através de espectroscopia de infravermelho transformada por Fourier (FTIR). Os resultados mostraram que as nanopartículas formadas possuem uma forma esférica/oval, um tamanho adequado, carga global positiva e eficiências de encapsulação do plasmídeo elevadas o que indica que são adequadas para a captação celular, internalização e libertação de genes. Além disso, estudos de estabilidade demonstraram que o péptido RALA é capaz de proteger o pDNA encapsulado das nucleases séricas e o ensaio de brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl) -2,5-difenil tetrazolium (MTT) mostrou que estes sistemas são biocompatíveis. Experiências de microscopia confocal e de live cell imaging confirmaram a localização intracelular de nanopartículas e a co-localização do plasmídeo no núcleo, logo após 2 h de transfecção. Além disso, a transfecção in vitro de células HeLa mediada pelos vetores RALA/pDNA permitiu a deteção de transcritos de mRNA por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) e expressão da proteína p53 por western blot. Um kit de ensaio de imunoabsorsão enzimático (ELISA) permitiu quantificar os níveis de proteína produzidos. A partir destes progressos, a indução de apoptose pelos sistemas RALA/pDNA nestas células cancerígenas do colo do útero foi avaliada. A ativação da caspase-3 foi monitorizada por meio de um ensaio colorimétrico e o ensaio de deteção de células em apoptose por TUNEL permitiu confirmar a fragmentação do DNA nuclear após transfecção com os poliplexos. Por último, um ensaio de western blot para marcação da proteína BAX permitiu perceber que a morte celular observada nas células tumorais transfetadas pelos nanos sistemas RALA/pDNA foi induzida pela via de apoptose intrínseca mediada pela BAX que por sua vez foi ativada pela suplementação do nível do supressor de tumor p53 nestas células. Em suma, o conjunto de resultados apresentados no presente trabalho revelam que o vetor RALA/pDNA parece ser adequado para aplicação na terapia génica do cancro. | por |
| dc.identifier.tid | 202349039 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/10086 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Dna Plasmídico Codificante Para A P53 | por |
| dc.subject | Nanopartículas | por |
| dc.subject | Péptido Rala | por |
| dc.subject | Proteína P53 | por |
| dc.subject | Terapia Génica do Cancro. | por |
| dc.title | Cancer gene therapy | por |
| dc.title.alternative | Design, development and in vitro evaluation of a plasmid DNA delivery system | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.embargofct | Contem dados temporariamente confidenciais | por |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.name | 2º Ciclo em Biotecnologia | por |
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