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Authors
Abstract(s)
Cancer is among the leading causes of death worldwide. By 2040 it is expected that the
number of new cancer cases will rise to 29.5 million and the number of cervical cancerrelated deaths to 16.4 million. Generally, cancer incidence rate increases in countries
with highest life expectancy, education level and standard of living. However, for cervical
cancer the reverse happens, its incidence is higher in less developed countries, due to the
lack of proper awareness, screening programs, inaccessibility to proper diagnosis and
efficient treatment procedures, these facts lead to a late diagnosis and consequently low
survival rates.
Human Papillomavirus (HPV), a highly sexually transmissible virus, is the main agent in
cervical cancer. Around 79 % of the diagnosed causes are attributed to HPV-16 and -18.
The severity of symptoms is usually associated with the affinity presented by
oncoproteins E6 and E7 within each HPV type toward the target protein, p53, a tumour
suppressor, and pRb, a retinoblastoma protein, respectively. Thus, the deregulation of
these proteins’ expression leads to invasion, proliferation, and survival of cancer cells. A
plethora of strategies are being developed to detect and prevent the disease, with antiHPV vaccines being at the front. However, in less developed countries, with poor health
resources, the preventative measures do not always work, and new therapies are being
developed to treat this type of cancer.
Gene therapy has been increasingly used since it allows the correction of a genetic effect
while also facilitating for an induced cell death. Thus, plasmid DNA that encodes the p53
gene can be a promising approach to combat cervical cancer. However, pDNA use is
limited since it is easily degraded by various agents, so a delivery system is needed to
carry pDNA to the target cells. Calcium phosphate nanoparticle are promising delivery
systems since they are composed of ions that naturally exist in the human body, and its
degradation does not entail negative consequences for the patient.
In this context, the present work’s focus is the development of plasmid DNA-loaded
calcium phosphate nanoparticles and further functionalization with folic acid for a
targeted delivery to HPV positive cancer cells.
Initially, the delivery system formulation was optimized resulting in delivery systems
presenting a size of 76.34 ± 34.08 nm, with a polydispersity index (PdI) of 0.40 ± 0.09
and a surface charge of – 20.90 ± 0.90 mV. pDNA inclusion was performed through an
adsorption approach yielding a size of 133.13 ± 58.12 nm, PdI of 0.65 ± 0.17 and a surface charge of – 23.70 ± 1.10 mV with an encapsulation efficiency of approximately 100 %.
Folic acid loading was investigated, and two methods were chosen, firstly when folic acid
is added in the precursor calcium solution (CaP-NP/FACa) and also when folic acid is
added through adsorption (CaP-NP/FAAd), which exhibited a folic acid loading
efficiency of approximately 92 and 70 %, respectively. The CaP-NP/pDNA/FAAd
achieved an efficiency of approximately 100 % for pDNA encapsulation and
approximately 99.6 % for folic acid loading, with a size of 112.63 ± 19.81 nm, PdI of 0.50
± 0.22 and a surface charge of – 27.40 ± 0.69 mV. The CaP-NP/pDNA/FACa presented
an encapsulation efficiency of pDNA in the nanoparticles of 100 % and an efficiency of
approximately 73 % for the loading of folic acid, with a size of 110.42 ± 65.71 nm, PdI of
0.50 ± 0.07 and a charge of – 22.20 ± 0.60 mV.
Overall, the in vitro assays showed no inherent cytotoxicity for the CaP-NPs, with
viability reduction only in higher concentrations (500 and 1000 µg/mL). The delivery
systems did not affect the healthy cells viability but decreased the viability in the cancer
cell line. Cell internalization was evaluated through confocal microscopy, which showed
significant uptake in both cell lines. The formulations presenting pDNA and folic acid, in
the calcium solution (CaP-NP/pDNA/FACa) and adsorbed after the nanoparticle
formulation (CaP-NP/pDNA/FAAd), presented high accumulation in cancer cells. PCR
evaluation seems to present increased expression values of p53 when the cancer cell line
was transfected with both CaP-NP/pDNA and CaP-NP/pDNA/FACa.
The present work demonstrated that CaP-NPs, loaded with pDNA and modified with
folic acid, show a therapeutic effect, and represents a promising treatment for cervical
cancer.
O cancro representa uma das principais causas de morte em todo o mundo. Até 2040, estimasse que o número de novos casos de cancro aumente para 29,5 milhões e o número de mortes associadas aumente para 16,4 milhões. Na maioria dos casos, a taxa de incidência tem aumentado nos países com maior esperança média de vida, nível de educação e qualidade de vida. No entanto, no caso do cancro do colo do útero, acontece o oposto, a sua incidência é maior em países menos desenvolvidos, devido à falta de consciencialização sobre a doença, programas de rastreio e procedimentos de tratamento eficazes, factos que levam a um diagnóstico tardio e, consequentemente, a taxas de sobrevivência baixas. O vírus do papiloma humano (HPV), é um vírus sexualmente transmissível, e a principal causa da ocorrência do cancro do colo do útero. Cerca de 79 % dos casos diagnosticados são atribuídos às estirpes de maior risco, HPV-16 e HPV-18. A gravidade dos sintomas está associada à afinidade das oncoproteínas E6 e E7 pelas proteínas supressoras de tumores, p53, e proteína do retinoblastoma, pRb, respetivamente; uma vez que desregulam a expressão destas proteínas levando à invasão, proliferação e sobrevivência das células cancerígenas. Várias estratégias estão a ser desenvolvidas para detetar e prevenir esta doença, tais como vacinas contra o HPV. No entanto, em países menos desenvolvidos as medidas preventivas nem sempre funcionam, pelo que novas terapêuticas estão a ser desenvolvidas para o tratamento mais eficiente desta patologia. A terapia génica tem sido amplamente explorada nos últimos tempos por permitir corrigir um determinado defeito genético ou até mesmo induzir a morte programada de uma célula anormal. Assim, o DNA plasmídico que codifica o gene da p53 representa uma abordagem promissora para combater o cancro do colo do útero. No entanto, o seu uso é limitado, uma vez que é facilmente degradado por vários agentes, sendo necessário um sistema de entrega para proteger, transportar e entregar o pDNA às células alvo. Nanopartículas de fosfato de cálcio apresentam benefícios uma vez que são compostas por iões que existem naturalmente no corpo humano e a sua degradação não implica consequências negativas. Neste contexto, o foco principal do presente trabalho é o desenvolvimento de nanopartículas de fosfato de cálcio para encapsular pDNA e serem funcionalizadas com ácido fólico para uma entrega direcionada às células cancerígenas HPV positivas Inicialmente, as condições da formulação deste sistema de entrega foram otimizadas, resultando em sistemas com tamanhos de 76,34 ± 34,08 nm, com índice de polidispersividade (PdI) de 0,40 ± 0,09 e uma carga superficial de – 20,90 ± 0,90 mV. A inclusão do pDNA foi realizada através do método de adsorção, resultando num tamanho de 133,13 ± 58,12 nm, PdI de 0,65 ± 0,17 e uma carga superficial de – 23,70 ± 1,10 mV, com uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 100 %. Posteriormente, foi explorada a funcionalização com ácido fólico tendo sido escolhidas duas metodologias de formulação, a primeira consiste na adição do ácido fólico na solução precursora de cálcio (CaP-NP/FACa) e a segunda consiste na adição do ácido fólico por adsorção após a formulação (CaP-NP/FAAd). Estas formulações apresentaram uma eficiência de loading deste ligando de aproximadamente 70 e 92 %, respetivamente. Após a inclusão de pDNA nos sistemas, a formulação CaP-NP/pDNA/FAAd apresentou uma eficiência de aproximadamente 100 % para a encapsulação de pDNA e aproximadamente 99,6 % para o ácido fólico, com um tamanho de 112,63 ± 19,81 nm, PdI de 0,50 ± 0,22 e uma carga superficial de – 27,40 ± 0,69 mV. A formulação CaPNP/pDNA/FACa apresentou uma eficiência de encapsulação de pDNA de aproximadamente 100 % e uma eficiência de aproximadamente 73 % para a funcionalização com ácido fólico, com um tamanho de 110,42 ± 65,71 nm, PdI de 0,50 ± 0,07 e uma carga superficial de – 22,20 ± 0,60 mV. De forma geral, os ensaios in vitro não mostraram citotoxicidade inerente às CaP-NPs. Somente foi observada a diminuição da viabilidade celular quando foram aplicadas concentrações elevadas (500 e 1000 µg/mL) destes sistemas. Os sistemas de entrega não afetaram a viabilidade das células saudáveis, mas diminuíram a viabilidade das células cancerígenas. A internalização das nanopartículas foi verificada através de microscopia confocal, tendo se observado elevada internalização em ambas as linhas celulares, com particular incidência nas células cancerígenas. As formulações de pDNA com inclusão do ácido fólico na solução de cálcio (CaP-NP/pDNA/FACa) e adsorvido após a formulação (CaP-NP/pDNA/FAAd) parecem ter melhor capacidade de internalização. A avaliação por PCR parece apresentar um nível superior de transcritos de p53 na linha celular cancerígena quando a transfeção foi realizada com CaP-NP/pDNA e com CaPNP/pDNA/FACa. De modo geral, o presente trabalho demonstrou que os sistemas CaP-NP apresentam o efeito terapêutico desejado e mostram-se promissores para o tratamento do cancro do colo do útero.
O cancro representa uma das principais causas de morte em todo o mundo. Até 2040, estimasse que o número de novos casos de cancro aumente para 29,5 milhões e o número de mortes associadas aumente para 16,4 milhões. Na maioria dos casos, a taxa de incidência tem aumentado nos países com maior esperança média de vida, nível de educação e qualidade de vida. No entanto, no caso do cancro do colo do útero, acontece o oposto, a sua incidência é maior em países menos desenvolvidos, devido à falta de consciencialização sobre a doença, programas de rastreio e procedimentos de tratamento eficazes, factos que levam a um diagnóstico tardio e, consequentemente, a taxas de sobrevivência baixas. O vírus do papiloma humano (HPV), é um vírus sexualmente transmissível, e a principal causa da ocorrência do cancro do colo do útero. Cerca de 79 % dos casos diagnosticados são atribuídos às estirpes de maior risco, HPV-16 e HPV-18. A gravidade dos sintomas está associada à afinidade das oncoproteínas E6 e E7 pelas proteínas supressoras de tumores, p53, e proteína do retinoblastoma, pRb, respetivamente; uma vez que desregulam a expressão destas proteínas levando à invasão, proliferação e sobrevivência das células cancerígenas. Várias estratégias estão a ser desenvolvidas para detetar e prevenir esta doença, tais como vacinas contra o HPV. No entanto, em países menos desenvolvidos as medidas preventivas nem sempre funcionam, pelo que novas terapêuticas estão a ser desenvolvidas para o tratamento mais eficiente desta patologia. A terapia génica tem sido amplamente explorada nos últimos tempos por permitir corrigir um determinado defeito genético ou até mesmo induzir a morte programada de uma célula anormal. Assim, o DNA plasmídico que codifica o gene da p53 representa uma abordagem promissora para combater o cancro do colo do útero. No entanto, o seu uso é limitado, uma vez que é facilmente degradado por vários agentes, sendo necessário um sistema de entrega para proteger, transportar e entregar o pDNA às células alvo. Nanopartículas de fosfato de cálcio apresentam benefícios uma vez que são compostas por iões que existem naturalmente no corpo humano e a sua degradação não implica consequências negativas. Neste contexto, o foco principal do presente trabalho é o desenvolvimento de nanopartículas de fosfato de cálcio para encapsular pDNA e serem funcionalizadas com ácido fólico para uma entrega direcionada às células cancerígenas HPV positivas Inicialmente, as condições da formulação deste sistema de entrega foram otimizadas, resultando em sistemas com tamanhos de 76,34 ± 34,08 nm, com índice de polidispersividade (PdI) de 0,40 ± 0,09 e uma carga superficial de – 20,90 ± 0,90 mV. A inclusão do pDNA foi realizada através do método de adsorção, resultando num tamanho de 133,13 ± 58,12 nm, PdI de 0,65 ± 0,17 e uma carga superficial de – 23,70 ± 1,10 mV, com uma eficiência de encapsulação de aproximadamente 100 %. Posteriormente, foi explorada a funcionalização com ácido fólico tendo sido escolhidas duas metodologias de formulação, a primeira consiste na adição do ácido fólico na solução precursora de cálcio (CaP-NP/FACa) e a segunda consiste na adição do ácido fólico por adsorção após a formulação (CaP-NP/FAAd). Estas formulações apresentaram uma eficiência de loading deste ligando de aproximadamente 70 e 92 %, respetivamente. Após a inclusão de pDNA nos sistemas, a formulação CaP-NP/pDNA/FAAd apresentou uma eficiência de aproximadamente 100 % para a encapsulação de pDNA e aproximadamente 99,6 % para o ácido fólico, com um tamanho de 112,63 ± 19,81 nm, PdI de 0,50 ± 0,22 e uma carga superficial de – 27,40 ± 0,69 mV. A formulação CaPNP/pDNA/FACa apresentou uma eficiência de encapsulação de pDNA de aproximadamente 100 % e uma eficiência de aproximadamente 73 % para a funcionalização com ácido fólico, com um tamanho de 110,42 ± 65,71 nm, PdI de 0,50 ± 0,07 e uma carga superficial de – 22,20 ± 0,60 mV. De forma geral, os ensaios in vitro não mostraram citotoxicidade inerente às CaP-NPs. Somente foi observada a diminuição da viabilidade celular quando foram aplicadas concentrações elevadas (500 e 1000 µg/mL) destes sistemas. Os sistemas de entrega não afetaram a viabilidade das células saudáveis, mas diminuíram a viabilidade das células cancerígenas. A internalização das nanopartículas foi verificada através de microscopia confocal, tendo se observado elevada internalização em ambas as linhas celulares, com particular incidência nas células cancerígenas. As formulações de pDNA com inclusão do ácido fólico na solução de cálcio (CaP-NP/pDNA/FACa) e adsorvido após a formulação (CaP-NP/pDNA/FAAd) parecem ter melhor capacidade de internalização. A avaliação por PCR parece apresentar um nível superior de transcritos de p53 na linha celular cancerígena quando a transfeção foi realizada com CaP-NP/pDNA e com CaPNP/pDNA/FACa. De modo geral, o presente trabalho demonstrou que os sistemas CaP-NP apresentam o efeito terapêutico desejado e mostram-se promissores para o tratamento do cancro do colo do útero.
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Keywords
Ácido Fólico Cancro do Colo do Útero Dna Plasmídico Vírus do Papiloma Humano - HPV Nanopartículas de Fosfato de Cálcio P53