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Abstract(s)
In 2020, more than 1.4 million new prostate cancer (PCa) cases were diagnosed in man worldwide with approximately 375,000 mortal victims. Nowadays, the lack of prognostic and predictive biomarkers associated to the poor effectiveness and specificity of the available therapies, demand the identification of novel and highly specific agents aiming to establish a tailor-made theragnostic strategy targeting PCa.
The Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) is an integral six-transmembrane protein over-expressed in PCa, in contrast with non-tumoral tissues and vital organs, wherein the expression levels of STEAP1 are reduced or absent. Based on the amino-acid sequence, secondary structure, transmembrane topology, and cellular localization, STEAP1 play a crucial role in cellular communications and cell adhesion processes as a transporter protein and ion channel, and in the stimulation of cell growth by increasing the intracellular levels of reactive oxygen species, ultimately contributing to tumor progression and aggressiveness. Moreover, it is capable of reducing extracellular metal-ion complexes and molecular oxygen through the biological behavior of heme-binding site, playing a role in metal metabolism. These biological features and promising results of several in vitro and in vivo studies emphasize the usefulness of STEAP1 as a promising biomarker or target for anti-cancer therapies. However, high-resolution structures for STEAP1 are not available, highlighting the lack of detailed structural and functional knowledge on the target protein, which impairs the complete understanding of its biological role in PCa. So far, only one structure of full-length human STEAP1 was solved by cryogenic-Electron Microscopy (cryo-EM) (PDB code: 6y9B, 2.97 Å resolution). Thus, this Thesis proposes the implementation of a biotechnology laboratorial hands-on platform, starting with the biosynthesis towards the purification of the STEAP1 protein, to ultimately discover antagonist biological molecules or inhibitory drugs that will be able to block the oncogenic effects triggered by the target.
Firstly, we expressed the full-length human native STEAP1 in Lymph Node Carcinoma of the Prostate (LNCaP) cell cultures followed by its isolation using a hydrophobic Butyl-Sepharose resin and co-immunoprecipitation as polishing strategy to recover a STEAP1 sample with a high degree of purity. The purified sample was highly thermostable in the absence of a membrane-mimicking environment, hence, not requiring the addition of a specific buffer or additive to preserve its α-helical secondary structure during purification as shown by circular dichroism. Then, we developed a mini-bioreactor strategy to scale-up the biosynthesis yield of STEAP1 using recombinant Komagataella pastoris X-33 Mut+ methanol-induced cultures. The influence of glycerol feeding profiles – constant, gradient, and exponential - in the STEAP1 expression levels was evaluated. The supplementation with 6% (v/v) DMSO and 1 M Proline increased the levels of stable N-glycosylated protein. The biological role of STEAP1 was validated in PCa neoplastic LNCaP and PC3 cell lines, showing an increment in cell proliferation. Then, a suitable solubilization and purification strategy for recombinant STEAP1 was explored. The target was effectively extracted and solubilized into 0.1% (v/v) Nonidet P-40 (NP-40) and η-Decyl-β-D-Maltopyranoside (DM) detergents and further isolated using Phenyl-Sepharose and Nickel-loaded resins as capture step. A combination with Q-Sepharose matrix was effective as polishing stage and allowed obtaining the target protein with high degree of purity and fully encapsulated in detergent micelles. Finally, the STEAP1 was recombinantly over-expressed in Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells. The solubilizing effectiveness of a wide-range of detergents and non-micellar agents using high-throughput technology was assessed. Equally, η-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)+Cholesteryl Hemisuccinate (CHS) and Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG)+CHS provided increased recovery of fully solubilized STEAP1. The target was successfully purified using Talon Co2+ resin coupled to Fluorescence-based Size Exclusion Chromatography (FSEC), in a sample with high protein quality, degree of purity, and with a protein mass of approximately 2 μg. The purified sample was analyzed by EM which showed several acceptable STEAP1 particles within the expected size for multimers.
Altogether, an optimized and reproducible bioprocess for the biosynthesis of both native and recombinant forms of STEAP1 protein and their successful purification in samples with increased degree of purity was established. These results are the starting point to structural studies aiming at high-resolution structures of the STEAP1 protein, which remains to be disclosed.
Em 2020, mais de 1.4 milhões de novos casos de cancro da próstata (CPa) foram diagnosticados em homens em todo o mundo originando aproximadamente 375,000 vítimas mortais. Em Portugal, cerca de 6,750 novos casos foram identificados e resultaram em sensivelmente 1,900 mortes, no mesmo período. Apesar dos progressos recentes na identificação de biomarcadores com aplicabilidade clínica no prognóstico precoce do CPa, juntamente com os resultados promissores de terapias sistémicas orientadas que reduzem a taxa de mortalidade associada à doença, opções de tratamento para prevenir estados avançados ou metástases são ainda escassos. Atualmente, as terapias disponíveis têm demonstrado falta de efetividade e especificidade, para além de induzirem toxicidade, efeitos secundários adversos, morbilidade cardíaca e disfunções cognitivas, que prejudicam a qualidade de vida dos pacientes. Como tal, é obrigatório identificar novos biomarcadores e agentes terapêuticos de elevada especificidade que permitam estabelecer uma estratégia personalizada de diagnóstico e tratamento do CPa. A Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) é uma proteína integral com seis domínios transmembranares conectados por dois loops intra e três loops extracelulares, localizada em tight- and gap-junctions, no citoplasma, e em membranas endossomais. A STEAP1 encontra-se sobre-expressa no CPa, ao contrário de tecidos não tumorais e órgãos vitais, nos quais os níveis de expressão da STEAP1 são reduzidos ou ausentes. Com base na sequência de aminoácidos, estrutura secundária, topologia transmembranar e localização celular, a STEAP1 desempenha um papel crucial na comunicação celular e em processos de adesão celular como proteína transportadora e canal iónico, e na estimulação do crescimento celular através do aumento dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio, contribuindo para a progressão e agressividade do tumor. Adicionalmente, a STEAP1 apresenta um papel ativo no metabolismo de metais, através da atividade biológica do grupo heme na redução de complexos metal-ião extracelulares e de oxigénio molecular. Assim, a função biológica da STEAP1 na tumorigénese e vias de sinalização do cancro, a sua expressão seletiva para o microambiente tumoral, e o seu arranjo estrutural, enfatizam a potencial utilização da STEAP1 como um biomarcador ou alvo para terapia anticancerígena. Efetivamente, inúmeros estudos in vitro e in vivo confirmaram que é possível controlar a progressão do CPa através de anticorpos monoclonais específicos para a STEAP1 e desenvolver vacinas anticancerígenas devido à imunogenicidade e reconhecimento da STEAP1 por parte dos linfócitos. Contudo, estruturas de alta resolução da STEAP1 não se encontram determinadas, destacando a falta de conhecimento de detalhes estruturais e funcionais, o que impede a compreensão total do papel biológico da STEAP1 no CPa. Até ao momento, apenas uma estrutura da STEAP1 humana foi resolvida por cryogenic-Electron Microscopy (cryo-EM) (6Y9B, resolução 2.97 Å), onde a proteína se encontra ligada a fragmentos de anticorpo num complexo trimérico. Assim, esta Tese propõe a implementação de uma plataforma biotecnológica laboratorial desde a biossíntese até à purificação da proteína STEAP1 visando a sua caracterização estrutural e funcional, para que, no futuro, seja possível a descoberta de moléculas biológicas antagonistas ou moléculas com capacidade para bloquear os efeitos oncogénicos provocados por esta proteína. Neste trabalho, começámos por expressar a proteína STEAP1 humana nativa em culturas de células neoplásicas de CPa (Lymph Node Carcinoma of the Prostate, LNCaP). De seguida, desenvolvemos uma estratégia de purificação para a proteína de interesse, utilizando uma resina hidrofóbica de Butil-Sefarose. Curiosamente, foi possível isolar a STEAP1 das restantes proteínas heterólogas, com um único passo, na fase de captura, utilizando um tampão de purificação composto por 1.375 M de (NH4)2SO4. A co-imunoprecipitação foi definida como uma estratégia eficaz de polimento para recuperação da proteína STEAP1 com um grau de pureza elevado. A fração correspondente à proteína STEAP1 humana nativa demonstrou ser termicamente estável no tampão de purificação 10 mM Tris-HCl a pH 7.8, na ausência de um ambiente lipídico membranar artificial e dispensando a adição de aditivos ou tampões específicos, revelando uma temperatura de melting de 55.5 ºC. O arranjo estrutural da proteína purificada predominantemente composto por hélices α foi preservado durante as etapas de purificação, conforme comprovado em ensaios de dicroísmo circular e de estabilidade térmica. No entanto, a quantidade de STEAP1 recuperada foi significantemente reduzida para ser utilizada em ensaios posteriores de caracterização estrutural. Deste modo, desenvolvemos uma estratégia em mini-bioreator para aumentar o rendimento associado à biossíntese da STEAP1 utilizando culturas recombinantes de Komagataella pastoris X-33 Mut+, tipicamente induzidas por metanol. Nesta plataforma de produção recombinante, avaliamos a influência de perfis de alimentação de glicerol – constante, gradiente e exponencial – relativamente aos níveis de expressão da STEAP1. A combinação entre estratégias de alimentação constante de metanol e por gradiente de glicerol suplementadas com DMSO a 6% (v/v) e Prolina a 1 M possibilitaram obter níveis aumentados da proteína de interesse e, simultaneamente, reduzir potenciais fenómenos de agregação. De forma complementar, ensaios enzimáticos para a avaliação do padrão de glicosilação da STEAP1, permitiram confirmar que o perfil de alimentação utilizado está associado a um perfil N-glicosilado. Paralelamente, o papel funcional de atividade biológica da STEAP1 recombinante no microambiente tumoral e os efeitos potenciais na proliferação celular foram validados utilizado linhas celulares de CPa, LNCaP e PC3. Os resultados obtidos registam um incremento, estatisticamente significativo, na proliferação celular em ambas culturas o que sugere que a STEAP1 humana recombinante apresenta a capacidade de interagir e integrar a membrana de células de CPa. Após o design operacional da plataforma laboratorial, em larga escala, que providencia elevados rendimentos de produção, foi relevante explorar estratégias adequadas de solubilização e purificação para a proteína STEAP1 humana recombinante. A proteína foi eficientemente extraída e solubilizada na presença dos detergentes Nonidet P-40 (NP-40) e n-Decyl-β-D-Maltopyranoside (DM) a 0.1% (v/v). Após a recuperação inicial, a STEAP1 foi isolada de proteínas heterólogas provenientes de lisados iniciais utilizado, como passo de captura, a matriz hidrofóbica Fenil-Sefarose e de afinidade com iões de níquel, como metal imobilizado. A proteína de interesse foi recuperada nos passos de eluição com 10 mM Tris-HCl a pH 7.8 com uma concentração de 0.1% (v/v) NP-40 e com 175 mM de imidazole a pH 7.8 com a adição de 0.1% (v/v) de DM, respetivamente para a matriz hidrofóbica e de afinidade. A combinação com a matriz comum de troca aniónica Q-Sefarose foi eficaz como etapa de polimento final e permitiu obter a proteína alvo no passo de eluição com 500 mM de NaCl a pH 10, suplementado com 0.1% (v/v) de NP-40 e DM, de acordo com a proveniência da amostra pré-purificada, com um elevado grau de pureza e totalmente encapsulada em micelas lipídicas de detergente. Por fim, no âmbito da candidatura ao programa Instruct (PID: 11936), em colaboração com o Laboratório de Proteínas Membranares do Campus de Ciências e Inovação de Harwell, a STEAP1 foi sobre-expressa de forma recombinante numa conformação folded e estável, com rendimento superior a partir do construct pOPINEneo-TEV-eGFP-8His, utilizado células de mamífero Human Embryonic Kidney (HEK)-293. A eficácia de solubilização de diversos detergentes e agentes não micelares foi avaliada utilizado a tecnologia de high-throughput. Nesta fase, as amostras de STEAP1 solubilizadas com a combinação de detergentes n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)+Cholesteryl Hemisuccinate (CHS) e Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG)+CHS providenciaram níveis de fluorescência elevados, sugerindo níveis de recuperação aumentados da STEAP1. Estas amostras foram posteriormente purificadas com sucesso aplicando uma estratégia de cromatografia de afinidade utilizando uma resina de Talon Co2+ acoplada a um passo de Fluorescence-based Size Exclusion Chromatography (FSEC). A STEAP1 foi recuperada no passo de eluição com 300 mM de imidazole, numa amostra com elevado grau de pureza e uma massa de aproximadamente 2 μg de proteína pura. A homogeneidade da amostra purificada e distribuição da proteína de interesse foi posteriormente analisada por microscopia eletrónica. Os resultados demonstraram partículas de STEAP1 aceitáveis, com tamanhos variáveis entre 6 e 16 nm, que coincidem com o tamanho expectável para estruturas multiméricas da proteína. Em suma, a investigação experimental desenvolvida ao longo desta Tese de Doutoramento estabeleceu diferentes bioprocessos otimizados e reprodutíveis para a biossíntese de ambas formas nativa e recombinante da proteína STEAP1 e, consequentemente, para a purificação em amostras com elevado grau de pureza. Os resultados aqui obtidos poderão ser considerados como o ponto de partida para a obtenção de estruturas cristalinas com alta resolução da proteína STEAP1 numa conformação estável e funcional, que permanecem por descobrir. Assim, será possível, num futuro próximo, desenvolver novas biomoléculas antagonistas específicas ou ligandos inibitórios com a capacidade de bloquear os efeitos pró-cancerígenos desencadeados pela sobre-expressão da STEAP1 no CPa. Para além disso, este trabalho serve de base para potencialmente decifrar interações entre a STEAP1 e moléculas biológicas ao nível atómico, que poderão contribuir para elucidar qual o comportamento funcional e biológico da STEAP1 no microambiente do CPa.
Em 2020, mais de 1.4 milhões de novos casos de cancro da próstata (CPa) foram diagnosticados em homens em todo o mundo originando aproximadamente 375,000 vítimas mortais. Em Portugal, cerca de 6,750 novos casos foram identificados e resultaram em sensivelmente 1,900 mortes, no mesmo período. Apesar dos progressos recentes na identificação de biomarcadores com aplicabilidade clínica no prognóstico precoce do CPa, juntamente com os resultados promissores de terapias sistémicas orientadas que reduzem a taxa de mortalidade associada à doença, opções de tratamento para prevenir estados avançados ou metástases são ainda escassos. Atualmente, as terapias disponíveis têm demonstrado falta de efetividade e especificidade, para além de induzirem toxicidade, efeitos secundários adversos, morbilidade cardíaca e disfunções cognitivas, que prejudicam a qualidade de vida dos pacientes. Como tal, é obrigatório identificar novos biomarcadores e agentes terapêuticos de elevada especificidade que permitam estabelecer uma estratégia personalizada de diagnóstico e tratamento do CPa. A Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1 (STEAP1) é uma proteína integral com seis domínios transmembranares conectados por dois loops intra e três loops extracelulares, localizada em tight- and gap-junctions, no citoplasma, e em membranas endossomais. A STEAP1 encontra-se sobre-expressa no CPa, ao contrário de tecidos não tumorais e órgãos vitais, nos quais os níveis de expressão da STEAP1 são reduzidos ou ausentes. Com base na sequência de aminoácidos, estrutura secundária, topologia transmembranar e localização celular, a STEAP1 desempenha um papel crucial na comunicação celular e em processos de adesão celular como proteína transportadora e canal iónico, e na estimulação do crescimento celular através do aumento dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio, contribuindo para a progressão e agressividade do tumor. Adicionalmente, a STEAP1 apresenta um papel ativo no metabolismo de metais, através da atividade biológica do grupo heme na redução de complexos metal-ião extracelulares e de oxigénio molecular. Assim, a função biológica da STEAP1 na tumorigénese e vias de sinalização do cancro, a sua expressão seletiva para o microambiente tumoral, e o seu arranjo estrutural, enfatizam a potencial utilização da STEAP1 como um biomarcador ou alvo para terapia anticancerígena. Efetivamente, inúmeros estudos in vitro e in vivo confirmaram que é possível controlar a progressão do CPa através de anticorpos monoclonais específicos para a STEAP1 e desenvolver vacinas anticancerígenas devido à imunogenicidade e reconhecimento da STEAP1 por parte dos linfócitos. Contudo, estruturas de alta resolução da STEAP1 não se encontram determinadas, destacando a falta de conhecimento de detalhes estruturais e funcionais, o que impede a compreensão total do papel biológico da STEAP1 no CPa. Até ao momento, apenas uma estrutura da STEAP1 humana foi resolvida por cryogenic-Electron Microscopy (cryo-EM) (6Y9B, resolução 2.97 Å), onde a proteína se encontra ligada a fragmentos de anticorpo num complexo trimérico. Assim, esta Tese propõe a implementação de uma plataforma biotecnológica laboratorial desde a biossíntese até à purificação da proteína STEAP1 visando a sua caracterização estrutural e funcional, para que, no futuro, seja possível a descoberta de moléculas biológicas antagonistas ou moléculas com capacidade para bloquear os efeitos oncogénicos provocados por esta proteína. Neste trabalho, começámos por expressar a proteína STEAP1 humana nativa em culturas de células neoplásicas de CPa (Lymph Node Carcinoma of the Prostate, LNCaP). De seguida, desenvolvemos uma estratégia de purificação para a proteína de interesse, utilizando uma resina hidrofóbica de Butil-Sefarose. Curiosamente, foi possível isolar a STEAP1 das restantes proteínas heterólogas, com um único passo, na fase de captura, utilizando um tampão de purificação composto por 1.375 M de (NH4)2SO4. A co-imunoprecipitação foi definida como uma estratégia eficaz de polimento para recuperação da proteína STEAP1 com um grau de pureza elevado. A fração correspondente à proteína STEAP1 humana nativa demonstrou ser termicamente estável no tampão de purificação 10 mM Tris-HCl a pH 7.8, na ausência de um ambiente lipídico membranar artificial e dispensando a adição de aditivos ou tampões específicos, revelando uma temperatura de melting de 55.5 ºC. O arranjo estrutural da proteína purificada predominantemente composto por hélices α foi preservado durante as etapas de purificação, conforme comprovado em ensaios de dicroísmo circular e de estabilidade térmica. No entanto, a quantidade de STEAP1 recuperada foi significantemente reduzida para ser utilizada em ensaios posteriores de caracterização estrutural. Deste modo, desenvolvemos uma estratégia em mini-bioreator para aumentar o rendimento associado à biossíntese da STEAP1 utilizando culturas recombinantes de Komagataella pastoris X-33 Mut+, tipicamente induzidas por metanol. Nesta plataforma de produção recombinante, avaliamos a influência de perfis de alimentação de glicerol – constante, gradiente e exponencial – relativamente aos níveis de expressão da STEAP1. A combinação entre estratégias de alimentação constante de metanol e por gradiente de glicerol suplementadas com DMSO a 6% (v/v) e Prolina a 1 M possibilitaram obter níveis aumentados da proteína de interesse e, simultaneamente, reduzir potenciais fenómenos de agregação. De forma complementar, ensaios enzimáticos para a avaliação do padrão de glicosilação da STEAP1, permitiram confirmar que o perfil de alimentação utilizado está associado a um perfil N-glicosilado. Paralelamente, o papel funcional de atividade biológica da STEAP1 recombinante no microambiente tumoral e os efeitos potenciais na proliferação celular foram validados utilizado linhas celulares de CPa, LNCaP e PC3. Os resultados obtidos registam um incremento, estatisticamente significativo, na proliferação celular em ambas culturas o que sugere que a STEAP1 humana recombinante apresenta a capacidade de interagir e integrar a membrana de células de CPa. Após o design operacional da plataforma laboratorial, em larga escala, que providencia elevados rendimentos de produção, foi relevante explorar estratégias adequadas de solubilização e purificação para a proteína STEAP1 humana recombinante. A proteína foi eficientemente extraída e solubilizada na presença dos detergentes Nonidet P-40 (NP-40) e n-Decyl-β-D-Maltopyranoside (DM) a 0.1% (v/v). Após a recuperação inicial, a STEAP1 foi isolada de proteínas heterólogas provenientes de lisados iniciais utilizado, como passo de captura, a matriz hidrofóbica Fenil-Sefarose e de afinidade com iões de níquel, como metal imobilizado. A proteína de interesse foi recuperada nos passos de eluição com 10 mM Tris-HCl a pH 7.8 com uma concentração de 0.1% (v/v) NP-40 e com 175 mM de imidazole a pH 7.8 com a adição de 0.1% (v/v) de DM, respetivamente para a matriz hidrofóbica e de afinidade. A combinação com a matriz comum de troca aniónica Q-Sefarose foi eficaz como etapa de polimento final e permitiu obter a proteína alvo no passo de eluição com 500 mM de NaCl a pH 10, suplementado com 0.1% (v/v) de NP-40 e DM, de acordo com a proveniência da amostra pré-purificada, com um elevado grau de pureza e totalmente encapsulada em micelas lipídicas de detergente. Por fim, no âmbito da candidatura ao programa Instruct (PID: 11936), em colaboração com o Laboratório de Proteínas Membranares do Campus de Ciências e Inovação de Harwell, a STEAP1 foi sobre-expressa de forma recombinante numa conformação folded e estável, com rendimento superior a partir do construct pOPINEneo-TEV-eGFP-8His, utilizado células de mamífero Human Embryonic Kidney (HEK)-293. A eficácia de solubilização de diversos detergentes e agentes não micelares foi avaliada utilizado a tecnologia de high-throughput. Nesta fase, as amostras de STEAP1 solubilizadas com a combinação de detergentes n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)+Cholesteryl Hemisuccinate (CHS) e Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG)+CHS providenciaram níveis de fluorescência elevados, sugerindo níveis de recuperação aumentados da STEAP1. Estas amostras foram posteriormente purificadas com sucesso aplicando uma estratégia de cromatografia de afinidade utilizando uma resina de Talon Co2+ acoplada a um passo de Fluorescence-based Size Exclusion Chromatography (FSEC). A STEAP1 foi recuperada no passo de eluição com 300 mM de imidazole, numa amostra com elevado grau de pureza e uma massa de aproximadamente 2 μg de proteína pura. A homogeneidade da amostra purificada e distribuição da proteína de interesse foi posteriormente analisada por microscopia eletrónica. Os resultados demonstraram partículas de STEAP1 aceitáveis, com tamanhos variáveis entre 6 e 16 nm, que coincidem com o tamanho expectável para estruturas multiméricas da proteína. Em suma, a investigação experimental desenvolvida ao longo desta Tese de Doutoramento estabeleceu diferentes bioprocessos otimizados e reprodutíveis para a biossíntese de ambas formas nativa e recombinante da proteína STEAP1 e, consequentemente, para a purificação em amostras com elevado grau de pureza. Os resultados aqui obtidos poderão ser considerados como o ponto de partida para a obtenção de estruturas cristalinas com alta resolução da proteína STEAP1 numa conformação estável e funcional, que permanecem por descobrir. Assim, será possível, num futuro próximo, desenvolver novas biomoléculas antagonistas específicas ou ligandos inibitórios com a capacidade de bloquear os efeitos pró-cancerígenos desencadeados pela sobre-expressão da STEAP1 no CPa. Para além disso, este trabalho serve de base para potencialmente decifrar interações entre a STEAP1 e moléculas biológicas ao nível atómico, que poderão contribuir para elucidar qual o comportamento funcional e biológico da STEAP1 no microambiente do CPa.
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Cancro da Próstata Detergentes HEK-293 Imunoprecipitação Komagataella pastoris LNCaP Produção Recombinante Purificação STEAP1