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Authors
Abstract(s)
The lack of knowledge regarding the etiology of male infertility boosted several investigations focused on male reproductive structures, particularly on male gonads - the testes. These paired organs are pivotal not only for the correct maintenance of steroidogenesis, but also to allow the occurrence of spermatogenesis, the process through which immature germ cells grow and differentiate into spermatozoa. Within testes, Sertoli cells perform an essential role in the control of spermatogenesis by: (1) developing a structural and nutritional support; (2) establishing a protective barrier to germ cells, the blood-testis barrier; and (3) controlling the balance of the seminiferous tubular fluid composition. To achieve this balanced environment, which is critical to the maintenance of membrane potential, osmotic balance and to allow the fluid movement, Sertoli cells are supported by several membrane proteins, including Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) and Aquaporin-9.
CFTR is a glycoprotein responsible for transepithelial salt and water transport, regulating Cl-/HCO3- exchange. Malfunctions in this protein have been associated with severe clinical outcomes, such as Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens in male reproductive tract. In addition to its role, CFTR often interacts with several other plasma-membrane proteins, including Aquaporin-9. Aquaporin-9 is an Aquaglyceroporin permeable to water and to a variety of other solutes, including lactate, glycerol, urea, adenine and uracil. Several studies identified the close interaction between CFTR and Aquaporin-9 in the male reproductive tract, including in rat Sertoli cells. This specific interaction was further proved to be pivotal in water permeability and ionic balance, without which male infertility may be a reality. With that said, the full enlightenment of the molecular mechanisms behind these channels function in the human reproductive system is crucial.
Herein, we evaluated the physiological significance of Aquaporin-9 and CFTR mRNA and protein expression in human Sertoli cells primary cultures. We also investigated the repercussions of inhibiting each one of the proteins with specific inhibitors for Aquaporin-9 (Phloretin) and CFTR (CFTR(inh)-172) in human Sertoli cells viability and function.
Our results showed, for the first time, that Aquaporin-9 is highly expressed in human Sertoli cells. We were also able to demonstrate that Phloretin, at a concentration of 0.05 mM, significantly reduces GATA4 and SOX9 mRNA expression which, in accordance with a reduction on glutamine consumption, suggest that this inhibitor triggers an undifferentiation process of human Sertoli cells, highlighting the vital role of Aquaporin-9 in human male reproductive tract. Further investigation unveiled that CFTR is present in human Sertoli cells and that it may exist in a different isoform from the ones previously described. Protein inhibition by CFTR(inh)-172 (3 µM) also decreased significantly GATA4 and SOX9, similarly to what happened with the Phloretin-treated cells, which uncovers the possibility of a crucial interaction between Aquaporin-9 and CFTR, as it has been described in rat Sertoli cells.
We can conclude that this innovative investigation allowed the discovery of pivotal information regarding Aquaporin-9 and CFTR implications in human Sertoli cells. A lot of questions were raised with this study and the respective answers should be unveiled with future investigation.
A falta de conhecimento face à etiologia da infertilidade masculina tem impulsionado diversas investigações focadas nas estruturas constituintes do sistema reprodutor masculino, em especial, nos testículos. Este par de órgãos é imprescindível não só para a adequada manutenção da esteroidogénese, mas também para permitir o progresso da espermatogénese, o processo através do qual as células germinativas imaturas se multiplicam e diferenciam em espermatozoides. É nos testículos que podemos encontrar as células de Sertoli, que desempenham um papel fundamental no controlo da espermatogénese através: (1) do suporte estrutural e nutricional das células germinativas; (2) da formação da barreira hemato-testicular; e (3) do controlo da composição do fluido luminal dos túbulos seminíferos. De facto, a obtenção de um ambiente homeodinâmico nos túbulos seminíferos é imprescindível para a manutenção do potencial de membrana, do balanço osmótico e do movimento de fluidos. As células de Sertoli são contribuidoras-chave para esta regulação, pois possuem inúmeras proteínas de membrana, entre as quais se podem destacar o Regulador da Condutância Transmembranar da Fibrose Cística (CFTR) e a Aquaporina-9. O CFTR é uma glicoproteína responsável pelo transporte transepitelial de água e sais, mediando a troca de Cl- e HCO3- entre as células e o meio. Alterações na função desta proteína têm sido associadas a prognósticos clínicos severos, levando muitas vezes à morte do indivíduo. É frequentemente observada uma ausência bilateral congénita dos vas deferens no sistema reprodutor masculino. Para além da sua função principal, o CFTR frequentemente interage com várias proteínas de membrana, incluindo a Aquaporina-9. A Aquaporina-9 é uma aquagliceroporina que, para além do seu papel como canal transportador de água, é também permeável a uma variedade de outros solutos, incluindo lactato, glicerol, ureia, adenina e uracilo. Estudos anteriores identificaram uma interação direta entre o CFTR e a Aquaporina-9 em células de Sertoli de rato. Esta interação foi comprovada como sendo importante na permeabilidade de água e no balanço iónico, sem o qual a infertilidade masculina seria uma realidade. Com esta informação-base, torna-se imprescindível a descoberta dos mecanismos moleculares que estarão por detrás da função destes canais (e sua possível interação) nas células de Sertoli do sistema reprodutor masculino humano. Com o desenvolvimento deste trabalho pretendemos avaliar a significância fisiológica da expressão da Aquaporina-9 e do CFTR em culturas primárias de células de Sertoli humanas. Adicionalmente, também foram investigadas as repercussões da inibição de cada uma destas proteínas, recorrendo à Floretina (inibidor da Aquaporina-9) e ao CFTR(inh)-172 (inibidor do CFTR), na viabilidade e função das células de Sertoli humanas. Os resultados por nós obtidos identificaram, pela primeira vez, que a Aquaporina-9 é altamente expressa nas células de Sertoli humanas. Provámos também que a Floretina reduz significativamente a expressão do mRNA do GATA4 e do SOX9 o que, associado à redução observada no consumo de glutamina, sugere que este inibidor da Aquaporina-9 despoleta um processo de desdiferenciação nas células de Sertoli humanas. Este resultado implicaria o desenvolvimento de um perfil infértil num modelo in vivo, destacando-se assim o papel vital da Aquaporina-9 na reprodução masculina humana. A nossa investigação também permitiu descobrir que o mRNA do CFTR se encontra expresso nas células de Sertoli humanas, revelando, ainda assim, um peso molecular diferente do presente em outros órgão/organismos previamente estudados. Este resultado permitiu-nos concluir que, muito possivelmente, estaremos na presença de uma nova isoforma deste transportador, específica das células de Sertoli humanas. A inibição da proteína pelo CFTR(inh)-172 diminuiu significativamente a expressão do mRNA do GATA4 e do SOX9, em semelhança com o grupo tratado com Floretina, o que reforça a possibilidade de uma interação entre a Aquaporina-9 e o CFTR no sistema reprodutor masculino. Podemos assim concluir que esta inovadora investigação permitiu a descoberta de informação imprescindível relativamente à implicação da Aquaporina-9 e do CFTR na manutenção homeostática das células de Sertoli humanas. Deve ainda acrescentar-se que várias questões foram levantadas com este estudo e que as respetivas respostas deverão ser reveladas em estudos futuros.
A falta de conhecimento face à etiologia da infertilidade masculina tem impulsionado diversas investigações focadas nas estruturas constituintes do sistema reprodutor masculino, em especial, nos testículos. Este par de órgãos é imprescindível não só para a adequada manutenção da esteroidogénese, mas também para permitir o progresso da espermatogénese, o processo através do qual as células germinativas imaturas se multiplicam e diferenciam em espermatozoides. É nos testículos que podemos encontrar as células de Sertoli, que desempenham um papel fundamental no controlo da espermatogénese através: (1) do suporte estrutural e nutricional das células germinativas; (2) da formação da barreira hemato-testicular; e (3) do controlo da composição do fluido luminal dos túbulos seminíferos. De facto, a obtenção de um ambiente homeodinâmico nos túbulos seminíferos é imprescindível para a manutenção do potencial de membrana, do balanço osmótico e do movimento de fluidos. As células de Sertoli são contribuidoras-chave para esta regulação, pois possuem inúmeras proteínas de membrana, entre as quais se podem destacar o Regulador da Condutância Transmembranar da Fibrose Cística (CFTR) e a Aquaporina-9. O CFTR é uma glicoproteína responsável pelo transporte transepitelial de água e sais, mediando a troca de Cl- e HCO3- entre as células e o meio. Alterações na função desta proteína têm sido associadas a prognósticos clínicos severos, levando muitas vezes à morte do indivíduo. É frequentemente observada uma ausência bilateral congénita dos vas deferens no sistema reprodutor masculino. Para além da sua função principal, o CFTR frequentemente interage com várias proteínas de membrana, incluindo a Aquaporina-9. A Aquaporina-9 é uma aquagliceroporina que, para além do seu papel como canal transportador de água, é também permeável a uma variedade de outros solutos, incluindo lactato, glicerol, ureia, adenina e uracilo. Estudos anteriores identificaram uma interação direta entre o CFTR e a Aquaporina-9 em células de Sertoli de rato. Esta interação foi comprovada como sendo importante na permeabilidade de água e no balanço iónico, sem o qual a infertilidade masculina seria uma realidade. Com esta informação-base, torna-se imprescindível a descoberta dos mecanismos moleculares que estarão por detrás da função destes canais (e sua possível interação) nas células de Sertoli do sistema reprodutor masculino humano. Com o desenvolvimento deste trabalho pretendemos avaliar a significância fisiológica da expressão da Aquaporina-9 e do CFTR em culturas primárias de células de Sertoli humanas. Adicionalmente, também foram investigadas as repercussões da inibição de cada uma destas proteínas, recorrendo à Floretina (inibidor da Aquaporina-9) e ao CFTR(inh)-172 (inibidor do CFTR), na viabilidade e função das células de Sertoli humanas. Os resultados por nós obtidos identificaram, pela primeira vez, que a Aquaporina-9 é altamente expressa nas células de Sertoli humanas. Provámos também que a Floretina reduz significativamente a expressão do mRNA do GATA4 e do SOX9 o que, associado à redução observada no consumo de glutamina, sugere que este inibidor da Aquaporina-9 despoleta um processo de desdiferenciação nas células de Sertoli humanas. Este resultado implicaria o desenvolvimento de um perfil infértil num modelo in vivo, destacando-se assim o papel vital da Aquaporina-9 na reprodução masculina humana. A nossa investigação também permitiu descobrir que o mRNA do CFTR se encontra expresso nas células de Sertoli humanas, revelando, ainda assim, um peso molecular diferente do presente em outros órgão/organismos previamente estudados. Este resultado permitiu-nos concluir que, muito possivelmente, estaremos na presença de uma nova isoforma deste transportador, específica das células de Sertoli humanas. A inibição da proteína pelo CFTR(inh)-172 diminuiu significativamente a expressão do mRNA do GATA4 e do SOX9, em semelhança com o grupo tratado com Floretina, o que reforça a possibilidade de uma interação entre a Aquaporina-9 e o CFTR no sistema reprodutor masculino. Podemos assim concluir que esta inovadora investigação permitiu a descoberta de informação imprescindível relativamente à implicação da Aquaporina-9 e do CFTR na manutenção homeostática das células de Sertoli humanas. Deve ainda acrescentar-se que várias questões foram levantadas com este estudo e que as respetivas respostas deverão ser reveladas em estudos futuros.
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Keywords
Aquaporina-9 Barreira Hemato-Testicular Células de Sertoli Cftr Espermatogénese Fertilidade Masculina Gata4 Sox9.