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Abstract(s)
Parkinson´s disease (PD) is the second most prevalent age-related neurodegenerative disorder around the world, with no cure currently in sight. This condition is caused by the gradual loss of the brain's dopaminergic neurons, in the substantia nigra pars compacta of the brain. This progressive neuronal loss leads to the typical symptoms of the disease characterized by rigidity, resting tremor, bradykinesia, and postural imbalance. Actually, the conventional therapy for this pathology consists in the administration of oral levodopa (L-DOPA), a natural dopamine precursor, and two enzymatic inhibitors: one for Catechol-O-Methyltransferase (COMT) and the other for the peripheral aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC). In terms of central nervous system, AADC can transform the administered L-DOPA in dopamine, and both substances, at central and peripheral level, can be metabolized by COMT. In humans, the COMT enzyme is present in two isoforms, a soluble isoform (S-COMT) and the membrane-bounded isoform (MB-COMT). Despite their similarities in the primary amino acid sequences, there is a accentuated difference in the kinetic behavior of both isoforms. MB-COMT tends to have a higher affinity for the substrate (lower Km) than SCOMT. On the other hand, S-COMT has a much higher catalytic reaction capacity (Vmax) than MB-COMT. Those differences in the kinetic behavior of the isoforms determined the role of the isoenzymes, with MB-COMT being physiologically more relevant due to its role in catecholamine methylation at physiological concentrations. Typically, COMT inhibitors enhance L-DOPA and dopamine bioavailability and effectiveness. However, they are often associated with toxicity and/or limited ability to cross the blood-brain barrier (BBB). This underscored the need to discover/ develop novel molecules with greater potency, reduced toxicity, and better pharmacokinetic properties than the existing inhibitors in clinical use. This dissertation investigates the potential of anthraquinones as potential COMT inhibitors, based on their molecular skeleton similarity with tolcapone. Anthraquinones are a subclass of quinones derived from anthracene with anti-tumor, anti-inflammatory, and neuroprotective properties, among others. They are characterized by having three planar rings with two ketones groups on the second ring. The inhibition of MB-COMT by nine anthraquinone family compounds was evaluated in vitro, using an analytical method previously described by the research group. From the obtained results, four of the nine compounds in study exhibited an enzymatic inhibition capacity close to 60%, at 100 µM. After, a cytotoxicity evaluation was performed for these 4 compounds by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assays using two different cell lines, normal human dermal fibroblasts (NHDF) and a rat dopaminergic neural cell line (N27). From that cytotoxic evaluation it was observed that the compounds in study displayed a cytotoxicity profile similar to the described inhibitor, tolcapone. In silico trials were performed using Autodock Vina complementing the in vitro findings by analyzing interactions and the positioning of the compounds in relation to the protein´s active center. The results were ranked based on the binding energy and key interactions with critical residues for MB-COMT´s catalytic capacity. Promising molecules were further analyzed using molecular dynamics simulations, using the commercial inhibitor tolcapone as a positive control. The principal Adsorption, Distribution, Metabolism, Excretion, and Toxicity (ADMET) properties were also predicted intending to complement the pharmacokinetic analysis and toxicity of the molecules. The in vitro and in silico obtained results suggest that purpurin, alizarin, 3-nitroalizarin and lucidin are promising candidates as COMT inhibitors, however, half maximal inhibitory concentration (IC50) assays for the enzymatic inhibition and for cytotoxicity, need to be performed to properly evaluate the potential of this molecules.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa, relacionada com o envelhecimento, mais prevalente em todo o mundo e, até à data, não existe perspetiva de cura. Esta patologia é causada pela perda gradual dos neurónios dopaminérgicos do cérebro, na substância nigra pars compacta do cérebro. Esta diminuição progressiva dos neurónios dopaminérgicos conduz ao aparecimento dos sintomas típicos da doença, caracterizados pela rigidez, o tremor de repouso, a bradicinésia e o desequilíbrio postural. Atualmente, a terapia convencional para esta patologia consiste na administração oral de levodopa (L-DOPA), um precursor natural de dopamina, e de dois inibidores enzimáticos: um da catecol-O-metiltransferase (COMT) e outro da Laminoácido descarboxilase aromática (AADC) periférica. Ao nível do sistema nervoso central, a AADC pode transformar a L-DOPA administrada em dopamina, e ambas as substâncias, ao nível central e periférico, podem ser metabolizadas pela COMT. Nos seres humanos, a enzima COMT está presente em duas isoformas, uma isoforma solúvel (SCOMT) e a isoforma ligada à membrana (MB-COMT). Apesar das suas semelhanças nas sequências primárias de aminoácidos, existem diferenças acentuadas no comportamento cinético de ambas as isoformas. A MB-COMT tende a ter maior afinidade pelo substrato (menor Km) em comparação a S-COMT. Por outro lado, a S-COMT apresenta uma capacidade catalítica de reação muito maior (Vmax) do que a MB-COMT. Essas diferenças no comportamento cinético das isoformas determinam o papel das isoenzimas, tornando a proteína membranar fisiologicamente a mais relevante, pela metilação típica de catecolaminas em concentrações fisiológicas. Tipicamente, os inibidores da COMT podem aumentar a biodisponibilidade e a eficácia da L-DOPA e da dopamina. No entanto, estão frequentemente associados a toxicidade e/ou incapacidade de atravessarem a barreira hematoencefálica (BBB). Assim, é crucial descobrir/desenvolver novas moléculas que apresentem maior potência, toxicidade reduzida e melhores propriedades farmacocinéticas do que os inibidores atualmente existentes em uso clínico. Nesta dissertação, analisamos o potencial de antraquinonas como potenciais inibidores da COMT, com base na semelhança com o esqueleto molecular do tolcapone. As antraquinonas são uma subclasse de quinonas derivadas do antraceno com propriedades anti-tumorais, anti-inflamatórias e neuroprotectoras, entre outras. Estas caracterizamse por terem três anéis planares com dois grupos cetona no anel central. A inibição da MB-COMT por parte de 9 compostos da família das antraquinonas foi avaliada através de estudos in vitro, com base num método analítico já descrito pelo grupo de investigação. De acordo com os resultados obtidos, 4 dos 9 compostos em estudo apresentaram uma capacidade de inibição enzimática próxima de 60%, a uma concentração de 100 µM. Posteriormente, foi efetuada uma avaliação da citotoxicidade para estes 4 compostos, através de ensaios de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio (MTT), utilizando duas linhas celulares diferentes, fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) e uma linha celular neural dopaminérgica de rato (N27). Desta avaliação citotóxica verificou-se que os compostos em estudo, apresentam um perfil citotóxico similar ao do inibidor descrito, o tolcapone. Ensaios in silico foram realizados utilizando o Autodock Vina de forma a complementar os resultados in vitro, através do estudo das interações e do posicionamento dos compostos em relação ao centro ativo da proteína. Os resultados alcançados foram escalonados com base na energia de ligação e nas interações principais dos resíduos alvo fundamentais para a capacidade catalítica da enzima MB-COMT. Posteriormente, as moléculas que se destacaram foram avaliadas por ensaios de dinâmica molecular, utilizando o inibidor comercial tolcapone como controlo positivo. As principais propriedades de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMET) foram também previstas com o intuito de complementar a análise farmacocinética e de toxicidade das moléculas. Os resultados obtidos, quer por estudos in vitro, quer in silico, sugerem que os compostos purpurina, alizarina, 3-nitroalizarina e lucidina, são promissores como potenciais novos inibidores da COMT; no entanto, é necessário efetuar estudos de concentração inibitória média (IC50) para a inibição enzimática e para a citotoxicidade, para avaliar adequadamente o potencial destas moléculas.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa, relacionada com o envelhecimento, mais prevalente em todo o mundo e, até à data, não existe perspetiva de cura. Esta patologia é causada pela perda gradual dos neurónios dopaminérgicos do cérebro, na substância nigra pars compacta do cérebro. Esta diminuição progressiva dos neurónios dopaminérgicos conduz ao aparecimento dos sintomas típicos da doença, caracterizados pela rigidez, o tremor de repouso, a bradicinésia e o desequilíbrio postural. Atualmente, a terapia convencional para esta patologia consiste na administração oral de levodopa (L-DOPA), um precursor natural de dopamina, e de dois inibidores enzimáticos: um da catecol-O-metiltransferase (COMT) e outro da Laminoácido descarboxilase aromática (AADC) periférica. Ao nível do sistema nervoso central, a AADC pode transformar a L-DOPA administrada em dopamina, e ambas as substâncias, ao nível central e periférico, podem ser metabolizadas pela COMT. Nos seres humanos, a enzima COMT está presente em duas isoformas, uma isoforma solúvel (SCOMT) e a isoforma ligada à membrana (MB-COMT). Apesar das suas semelhanças nas sequências primárias de aminoácidos, existem diferenças acentuadas no comportamento cinético de ambas as isoformas. A MB-COMT tende a ter maior afinidade pelo substrato (menor Km) em comparação a S-COMT. Por outro lado, a S-COMT apresenta uma capacidade catalítica de reação muito maior (Vmax) do que a MB-COMT. Essas diferenças no comportamento cinético das isoformas determinam o papel das isoenzimas, tornando a proteína membranar fisiologicamente a mais relevante, pela metilação típica de catecolaminas em concentrações fisiológicas. Tipicamente, os inibidores da COMT podem aumentar a biodisponibilidade e a eficácia da L-DOPA e da dopamina. No entanto, estão frequentemente associados a toxicidade e/ou incapacidade de atravessarem a barreira hematoencefálica (BBB). Assim, é crucial descobrir/desenvolver novas moléculas que apresentem maior potência, toxicidade reduzida e melhores propriedades farmacocinéticas do que os inibidores atualmente existentes em uso clínico. Nesta dissertação, analisamos o potencial de antraquinonas como potenciais inibidores da COMT, com base na semelhança com o esqueleto molecular do tolcapone. As antraquinonas são uma subclasse de quinonas derivadas do antraceno com propriedades anti-tumorais, anti-inflamatórias e neuroprotectoras, entre outras. Estas caracterizamse por terem três anéis planares com dois grupos cetona no anel central. A inibição da MB-COMT por parte de 9 compostos da família das antraquinonas foi avaliada através de estudos in vitro, com base num método analítico já descrito pelo grupo de investigação. De acordo com os resultados obtidos, 4 dos 9 compostos em estudo apresentaram uma capacidade de inibição enzimática próxima de 60%, a uma concentração de 100 µM. Posteriormente, foi efetuada uma avaliação da citotoxicidade para estes 4 compostos, através de ensaios de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio (MTT), utilizando duas linhas celulares diferentes, fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) e uma linha celular neural dopaminérgica de rato (N27). Desta avaliação citotóxica verificou-se que os compostos em estudo, apresentam um perfil citotóxico similar ao do inibidor descrito, o tolcapone. Ensaios in silico foram realizados utilizando o Autodock Vina de forma a complementar os resultados in vitro, através do estudo das interações e do posicionamento dos compostos em relação ao centro ativo da proteína. Os resultados alcançados foram escalonados com base na energia de ligação e nas interações principais dos resíduos alvo fundamentais para a capacidade catalítica da enzima MB-COMT. Posteriormente, as moléculas que se destacaram foram avaliadas por ensaios de dinâmica molecular, utilizando o inibidor comercial tolcapone como controlo positivo. As principais propriedades de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMET) foram também previstas com o intuito de complementar a análise farmacocinética e de toxicidade das moléculas. Os resultados obtidos, quer por estudos in vitro, quer in silico, sugerem que os compostos purpurina, alizarina, 3-nitroalizarina e lucidina, são promissores como potenciais novos inibidores da COMT; no entanto, é necessário efetuar estudos de concentração inibitória média (IC50) para a inibição enzimática e para a citotoxicidade, para avaliar adequadamente o potencial destas moléculas.
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Keywords
Doença de Parkinson Catecol-O-metiltransferase Inibidores Antraquinonas Parkinson´s disease Catechol-O-methyltransferase Inhibitors Anthraquinones