Publication
Adverse vascular effects of phthalates: Possible contribution to hypertension in pregnancy
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Bioquímica | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Oliveira, Maria Elisa Cairrão Rodrigues | |
| dc.contributor.advisor | Soares, Amadeu Mortágua Velho da Maia | |
| dc.contributor.advisor | Sousa, Miguel Castelo Branco Craveiro de | |
| dc.contributor.author | Mariana, Melissa Rodrigues | |
| dc.date.accessioned | 2025-01-08T16:59:18Z | |
| dc.date.embargo | 2028-01-06 | |
| dc.date.issued | 2024-12-18 | |
| dc.description.abstract | Phthalates are chemical compounds used as plasticizers to increase flexibility and elasticity of rigid polymers and as non-plasticizers as solvents and additives in cosmetics and personal care products. These compounds have low water solubility and since they are not covalently bound to the polymer they are easily released into the environment and absorbed by the human body. Afterwards, phthalates are rapidly metabolized into their respective monoesters being already detected in different biological samples, including blood, urine, saliva, amniotic fluid, umbilical cord blood and breast milk. In addition, phthalates can disrupt the endocrine system by binding to molecular targets and interfering with hormonal homeostasis, thus being classified as endocrine-disrupting compounds (EDCs). Due to these properties and their adverse effects, phthalates were classified as priority environmental pollutants by the United States Environmental Protection Agency (US EPA). Alongside this increase in exposure to phthalates, the incidence of cardiovascular diseases (CVD) has also increased over the years, with the occurrence of hypertensive disorders in pregnancy (HDP) being one of the main causes of maternal and foetal morbidity and mortality. There are several risk factors that influence the development of HDP, including exposure to EDCs, but the mechanisms involved are not yet known. Several studies have also suggested an association with phthalates, in rats they seem to promote changes in the vascular function, to affect the expression of proteins involved in cardiac function, to contribute to increased blood pressure, changes in lipid metabolism, and atherosclerosis. Thus, the aim of this thesis was to investigate how phthalates’ exposure affects the cardiovascular health, focusing on HDP. For that, studies were carried out on rat aorta and the human umbilical artery to evaluate the effects of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and diethyl phthalate (DEP) in the vascular function. In the first study, rat aorta devoid of endothelium was contracted with noradrenaline and potassium chloride (KCl) and then subjected to different concentrations of DEHP (0.001-100 μM) to assess the vascular reactivity. Besides, since Ca2+ levels are the main determinant of contraction and relaxation, DEHP effects on Ca2+ currents were also analysed using the A7r5 cells. The data obtained showed that DEHP caused a concentration-dependent vasorelaxation after contraction with KCl, and, at the highest concentrations, it inhibited both the basal and the BAY K8644-stimulated calcium currents. These results suggest that DEHP induces vasorelaxation of the rat aorta by inhibiting the L-type Ca2+ channels (LTCC). Then, the genomic and non-genomic effects of DEP on the rat aorta were analysed. Using the organ bath technique, DEP (0.001-1000 μM) was analysed after contraction of the arteries with noradrenaline and KCl. Similarly, to understand the possible mechanisms involved, the effects of DEP were analysed on the relaxing effect of nifedipine (NIF - specific calcium channel blocker) and sodium nitroprusside (SNP - soluble guanylate cyclase activator). Besides, through electrophysiology studies the non-genomic (occurring within a few minutes) and genomic (occurring after 24h of exposure) effects of DEP on the Ca2+ currents of the A7r5 cells were investigated. These showed that both the rapid and 24h effects of DEP exposure led to a decrease in LTCC currents, being in agreement with the vasorelaxation obtained through the organ bath experiments. For the first time, the vascular electrophysiological properties of an EDC were analysed after long-term exposure, concluding that DEP promotes an inhibition of the calcium current in the rat aorta, which may be responsible for electrical disturbances such as arrhythmias. To evaluate the effect of phthalates on maternal health, the last experimental work of this thesis analysed the contribution of DEP (0.001-1000 μM) in the development of gestational hypertension. Therefore, human umbilical arteries (HUA) were collected from normotensive and hypertensive pregnant women. To assess the non-genomic vascular effects, the HUA were pre-contracted with serotonin, histamine and KCl and then subjected to DEP, resulting in a vasorelaxation by interfering with Ca2+ channels and serotonin and histamine receptors. On the other hand, to assess the genomic effects, the arteries were incubated with DEP for 24h, and then the effects of NIF and SNP were analysed. The results showed that DEP seemed to act through the NO/sGC/cGMP/PKG signalling pathway, and to interfere with LTCC. In addition, primary culture of HUA smooth muscle cells was also performed for cell viability essays, showing that DEP has no toxic effect on these cells. Overall, this experimental work showed that DEP affects the HUA vascular resistance through disturbances in hormone and calcium homeostasis, suggesting that the development of hypertension in pregnancy may be a consequence of exposure to phthalates. In general, the results obtained show that phthalates modify the vascular homeostasis in both animals and humans, promoting vasorelaxation mainly through the inhibition of Ca2+ channels. This is the first time that an experimental study has been able to establish the link between exposure to DEP and gestational hypertension. We are beginning to unravel the mechanistic pathways involved in the vascular effects of phthalates that explain the pathological functional alterations of hypertension in pregnancy. However, more experimental studies are needed to understand how different classes and mixtures of phthalates affect the cardiovascular health during pregnancy and in future generations. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Os diésteres do ácido ftálico, habitualmente designados de ftalatos, são compostos químicos usados como plastificantes para aumentar a flexibilidade, a maleabilidade e a elasticidade de polímeros rígidos (ex. cloreto de polivinilo - PVC). Além disso, podem também ser utilizados como solventes e aditivos em cosméticos e produtos de higiene pessoal. Existem vários tipos de ftalatos, classificados de acordo com o peso molecular. Os de elevado peso molecular caracterizam-se por terem fatores de bioacumulação menores e são na sua maioria utilizados na indústria do plástico, em produtos domésticos e industriais, dispositivos médicos, embalagens de alimentos e brinquedos. Por outro lado, os ftalatos de baixo peso molecular, que possuem fatores de bioacumulação mais elevados, são utilizados principalmente em produtos de higiene pessoal e como solventes ou aditivos em fármacos e cosméticos. Os ftalatos caracterizam-se por terem baixa solubilidade em água e por não formarem ligações covalentes com os polímeros de que fazem parte. Desta forma, são facilmente libertados para o ambiente durante a sua produção, utilização ou eliminação e quando entram em contacto com fluídos lipofílicos, como o sangue e o plasma. Assim, podem ser facilmente absorvidos pelo corpo humano através de diferentes vias de exposição (ingestão, contacto dérmico, e exposição parenteral). Após absorção, os ftalatos são rapidamente metabolizados nos seus respetivos monoésteres, tendo sido detetados em diferentes amostras biológicas, incluindo sangue, urina, saliva, líquido amniótico, sangue do cordão umbilical e leite materno. Para além disso, os ftalatos têm a capacidade de interferir com o sistema endócrino, ligando-se a alvos moleculares e desregulando a homeostase hormonal, sendo assim classificados como disruptores endócrinos. Uma caraterística comum deste tipo de compostos é o facto de apresentarem uma curva dose-resposta não monotónica, ou seja, o seu efeito não é proporcional ao aumento da concentração. Este é um facto preocupante, uma vez que concentrações mais baixas de exposição podem causar efeitos adversos na saúde humana e no ambiente. Estas propriedades dos ftalatos, assim como os efeitos adversos, levaram a que a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América (US EPA) classificasse os ftalatos como poluentes ambientais prioritários, incluindo o ftalato de di(2-etilhexilo) (DEHP) e o ftalato de dietilo (DEP). Paralelamente ao aumento na exposição a ftalatos, também a incidência das doenças cardiovasculares (CVD) tem aumentado ao longo dos anos. Em ambos os casos, o atual estilo de vida é um fator importante, quer pelo consumo de produtos que contêm ftalatos na sua composição como pela alimentação estilo fast food e tendência para sedentarismo. As CVD são uma das principais causas de morte em todo o mundo, com um aumento de 25% de morte entre 2000 e 2019. Outra preocupação é quando estas doenças se desenvolvem ou se agravam durante a gravidez. Sabe-se que este é um período sensível e vulnerável, e a ocorrência das doenças hipertensivas na gravidez (HDP) torna-se uma das principais causas de morte e morbilidade materna e fetal. As HDP são classificadas em quatro categorias: hipertensão crónica, hipertensão gestacional, pré-eclâmpsia e pré-eclâmpsia sobreposta a hipertensão crónica, sendo esta última uma das formas mais graves. Existem vários fatores de risco que influenciam o desenvolvimento destas doenças, no entanto os mecanismos envolvidos ainda não são conhecidos. Vários estudos têm demonstrado uma associação entre o desenvolvimento das CVD, incluindo as HDP, e a exposição a EDCs, nomeadamente ftalatos. Sendo um dos ftalatos mais investigados ao longo dos anos, foi sugerido que o DEHP promove alterações da função vascular, afeta a expressão de proteínas envolvidas na função cardíaca e contribui para o aumento da pressão sanguínea em ratos. No caso do DEP, estudos em animais demonstraram que induz alterações do metabolismo lipídico, aterosclerose e síndrome metabólica. Por outro lado, estudos epidemiológicos sugerem uma associação entre a exposição a estes ftalatos e o desenvolvimento de CVD. No entanto, quer em estudos em animais como em humanos, as vias mecanísticas envolvidas ainda não são compreendidas. Tendo estes dados em consideração, o objetivo desta tese foi investigar qual o papel da exposição a ftalatos na saúde cardiovascular, incidindo nas HDP. Para isso, estudos vasculares em animais e em amostras humanas foram realizados. Nos primeiros, a artéria aorta de rato foi utilizada e o efeito de dois ftalatos de diferente peso molecular foi analisado, já o cordão umbilical foi utilizado para avaliar esse efeito em casos com e sem hipertensão gestacional. A fim de compreender as vias mecanísticas do DEHP, avaliou-se o seu efeito a curto prazo no músculo liso da aorta do rato. Para isso, estudos de contractilidade foram realizados recorrendo à técnica de banho de órgãos. Neste caso, anéis arteriais desprovidos de endotélio foram contraídos com noradrenalina e cloreto de potássio (KCl) e posteriormente sujeitos a diferentes concentrações de DEHP (0.001-100 μM) para avaliar a reatividade vascular. Para além disso, uma vez que a concentração de Ca2+ é o principal determinante nos mecanismos de contração e relaxamento, após cultura celular de células A7r5, ensaios de eletrofisiologia também foram realizados. Recorrendo à técnica de patch clamp na configuração whole-cell o efeito do DEHP nas mesmas concentrações foi avaliado sobre as correntes de Ca2+ do tipo L, quer nas correntes basais como após estimulação com BAY K8644. Os dados obtidos mostraram que o DEHP provocou um relaxamento das artérias após contração com KCl, sendo este relaxamento proporcional às concentrações testadas. Relativamente às correntes iónicas, o DEHP inibiu os canais de Ca2+, sendo este efeito mais proeminente nas concentrações mais elevadas. Estes resultados sugerem que o DEHP induz vasorelaxamento da aorta do rato através da inibição dos canais de Ca2+ do tipo L, o que está de acordo com a atividade estrogénica do DEHP, uma vez que já foi demonstrado que o 17β-estradiol inibe os canais de Ca2+ promovendo vasorelaxamento. O segundo trabalho experimental apresentado teve como principal objetivo analisar os efeitos genómicos e não genómicos dos ftalatos na aorta do rato, tanto ex vivo como in vitro. Através do banho de órgãos, o efeito vascular de diferentes concentrações de DEP (0.001-1000 μM) - ftalato de baixo peso molecular - foi analisado após contração das artérias com noradrenalina e KCl. Para além disso, para entender o possível mecanismo, o efeito do DEP foi também avaliado após adição dos agentes vasorelaxantes nifedipina (NIF – bloqueador específico dos canais de cálcio) e nitroprussiato de sódio (SNP – ativador da guanilato ciclase solúvel). Os resultados mostraram que o DEP promove um relaxamento mais proeminente nas artérias contraídas com KCl, e que, tendo em conta que o efeito induzido pela combinação de NIF com DEP é semelhante ao efeito da NIF, o vasorelaxamento das artérias parece ocorrer por inibição dos canais de Ca2+. Com recurso às células A7r5, foram realizados ensaios de viabilidade celular e da expressão de genes relacionados com a função vascular, os quais não apresentaram resultados significativos quando comparados com os respetivos controlos. Foram ainda realizados estudos de eletrofisiologia, avaliando os efeitos não genómicos (que ocorrem em poucos minutos) e genómicos (que ocorrem após 24h de exposição) do DEP sobre as correntes de Ca2+. Estes mostraram que, tanto os efeitos rápidos como os de 24h de exposição ao DEP levaram à diminuição das correntes de Ca2+ do tipo L, confirmando assim a hipótese de mecanismo sugerida pelos ensaios de contractilidade. Pela primeira vez, foram analisadas as propriedades eletrofisiológicas vasculares de um EDC após uma exposição de longo prazo, e os resultados permitiram concluir que o DEP promove uma inibição da corrente de cálcio da aorta do rato, que pode ser responsável por distúrbios elétricos, como arritmias. O último trabalho experimental apresentado foi ao encontro do principal objetivo desta tese, avaliar o efeito dos ftalatos na saúde materna. Para isso, a contribuição dos ftalatos no desenvolvimento da hipertensão gestacional e os mecanismos envolvidos foram analisados. Tendo em conta a elevada utilização de produtos cosméticos e cuidado pessoal pelas mulheres, o DEP foi o ftalato analisado neste trabalho. Para além disso, a gravidez apresenta um risco adicional dada a sua vulnerabilidade e sensibilidade. Assim, os efeitos do DEP (0.001-1000 μM) foram analisados na contractilidade de artérias umbilicais humanas (HUA) provenientes de dois grupos: mulheres grávidas normotensas e hipertensas. Recorrendo à técnica de banho de órgãos, as artérias sem endotélio foram contraídas com serotonina, histamina e KCl e posteriormente sujeitas às diferentes concentrações de DEP para avaliar os efeitos vasculares a curto prazo (não genómicos). Para avaliar os efeitos a longo prazo (genómicos), as artérias foram incubadas com DEP (0, 0.01, 1, 100 e 1000 μM) durante 24h, e o efeito da NIF e do SNP foi analisado para entender a possível contribuição dos canais de Ca2+ e da via do cGMP. Relativamente aos efeitos não genómicos, o DEP induz vasorelaxamento por interferir com os canais de Ca2+ e com os recetores de serotonina e histamina. Após uma exposição prolongada, o DEP parece atuar através da via de sinalização NO/sGC/cGMP/PKG, e interferir com os canais de Ca2+ do tipo L, diminuindo os efeitos vasorelaxantes. Além disso, cultura primária de células do músculo liso da HUA foi também realizada para estudos de viabilidade celular. Estes mostraram não haver diferenças significativas em relação ao controlo em ambos os grupos, concluindo assim que o DEP não apresenta efeito tóxico nestas células. De forma geral, este trabalho experimental mostrou que o DEP parece modular a resistência vascular da HUA através de mecanismos hormonais e de perturbações na homeostase do cálcio, concluindo que o desenvolvimento de hipertensão na gravidez pode ser uma consequência da exposição a ftalatos. Em suma, os resultados obtidos mostram que os ftalatos em estudo alteram a homeostase vascular, quer em animais quer em humanos, promovendo o vasorelaxamento principalmente através da inibição dos canais de Ca2+. Esta é a primeira vez que um trabalho experimental faz a ligação entre a exposição ao DEP e o desenvolvimento de hipertensão gestacional. Estamos assim a começar a desvendar as vias mecanísticas envolvidas nos efeitos vasculares dos ftalatos que explicam as alterações funcionais patológicas da hipertensão na gravidez. No entanto, mais estudos experimentais devem ser desenvolvidos para compreender como diferentes classes e misturas de ftalatos afetam a saúde cardiovascular durante a gravidez e nas gerações futuras. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101683430 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/14965 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | Health Sciences Research Centre | |
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| dc.relation | Centre for Environmental and Marine Studies | |
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| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ | pt_PT |
| dc.subject | Disruptores endócrinos | pt_PT |
| dc.subject | Ftalato de di(2-etilhexilo) | pt_PT |
| dc.subject | Ftalato de dietilo | pt_PT |
| dc.subject | Hipertensão gestacional | pt_PT |
| dc.subject | Doenças cardiovasculares | pt_PT |
| dc.subject | Artéria aorta de rato | pt_PT |
| dc.subject | Artéria umbilical humana | pt_PT |
| dc.subject | Células do músculo liso vascular | pt_PT |
| dc.subject | Canais de cálcio do tipo L | pt_PT |
| dc.subject | Eletrofisiologia | pt_PT |
| dc.subject | Vasorelaxamento | pt_PT |
| dc.subject | Vasoconstrição | pt_PT |
| dc.subject | Endocrine disrupting compounds | pt_PT |
| dc.subject | Cardiovascular diseases | pt_PT |
| dc.subject | Gestational hypertension | pt_PT |
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