Publication
Hair analysis for alcohol biomarkers: assessing excessive consumption in a student population
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Gallardo Alba, Maria Eugénia | |
| dc.contributor.advisor | Barroso, Mário Jorge Dinis | |
| dc.contributor.advisor | Passarinha, Luís António Paulino | |
| dc.contributor.author | Oppolzer, David Jerónimo | |
| dc.date.accessioned | 2016-07-28T15:39:16Z | |
| dc.date.available | 2016-07-28T15:39:16Z | |
| dc.date.issued | 2016-06 | |
| dc.description.abstract | Alcohol consumption within the student population has become an increasing health concern in several countries. The use of alcohol has deleterious consequences on intellectual performance of students, and can be associated with a variety of risky situations, as injuries, unplanned and unsafe sex, sexual and non-sexual violence, property damage and reckless driving. Monitoring alcohol consumption in the student population is therefore important to identify the degree of the problem and to assess consumption trends, allowing also for the implementation of adequate policies, as well as verifying their effectiveness. Alcohol consumption can be monitored using statistics, such as survey studies performed on the population by means of questionnaires. These approaches have relative efficiency and are widely used; however, considerable limitations are associated to their use, making them unreliable for clinical and/or forensic purposes. Alcohol biomarkers are measurable substances in a biological sample, whose presence indicates some form of exposure to alcohol, and their use to assess alcohol exposure in clinical and forensic scenarios has been applied in a variety of biological specimens in the past years. One of the most notable of these specimens is hair, which presents several advantages, including non-invasive collection, ease of availability, long windows of detection and low chance of adulteration. Hair testing for alcohol exposure relies mainly on the analysis of two biomarkers, ethyl glucuronide (EtG) and fatty acid ethyl esters (FAEEs). These markers have been widely applied in several studies, and were shown to present good sensitivity and specificity. Therefore, the objective of the present work was to evaluate the alcohol consumption on a university student population using two main approaches, one based on questionnaire analysis, and the second on the analytical determination of alcohol biomarkers in hair. A total of 1192 hair samples, and respective self-completion questionnaire were collected, 975 samples were analysed thereof. Through analysis of the questionnaires it was found that alcohol consumption started mostly at the age of 15, and that most of the students considered their consumption as moderate, while almost one-third consumed alcohol excessively at least once in the last month. Beer was reported to be the most consumed beverage, and drinking was widely preferred accompanied. Places for alcohol consumption are mostly public places, such as coffee bars. Higher ingested quantities of alcohol per drinking occasion were associated with the male genre, but both genres presented mean alcohol volumes indicating risky and excessive drinking. The use of other substances was also assessed, including tobacco, which was a habit in one-third of the students. The incidence of the use of illicit substances was similar, and cannabis was the most consumed substance, but mainly on rare occasions. The use of illicit substances was however associated with drinking events in more than 50% of the students. For alcohol biomarker analysis in hair, a method was developed for the analysis of EtG. The compound was extracted from the hair matrix by ultra-sonication with water, clean-up using mixed anion-exchange solid-phase extraction (SPE) and analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A second method was developed for the analysis of four FAEEs (ethyl myristate, palmitate, oleate and stearate). The compounds were extracted from the hair matrix by incubation with heptane, extracts were cleaned-up with aminopropyl SPE and analysed by gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Both methods were validated according to guidelines from the Food and Drug Administration (FDA) and International Conference on Harmonization (ICH). Assessed parameters included sensitivity, limits, linearity, precision and accuracy, recovery, stability and matrix effect. The methods were found to be selective, with a limit of quantification of 3 pg/mg for EtG and 30 pg/mg for each of the four FAEEs. Linearity was obtained in the ranges of 3 – 500 pg/mg for EtG and 30 – 5000 pg/mg for FAEEs, and precision and accuracy were found acceptable according to the guidelines. Overall recovery ranged from 74.79% and 97.90%, and processed EtG samples were stable for at least 96h, and FAEEs samples for at least 24h. Matrix effects were evaluated for EtG analysis and were not significant. Higher concentrations of both biomarkers were obtained for the male genre, and at the universities of Beira Interior and Coimbra. Based on hair sample results, individuals were categorized as abstinent, moderate or excessive drinkers, according to cut-off concentrations proposed by the Society of Hair Testing (SoHT) for both biomarkers. These values are 7 pg/mg of EtG, and 0.2 ng/mg (for 0-3 cm segments) or 0.4 ng/mg (for 0-6 cm segments) of FAEEs, to distinguish abstinence from moderate drinking. To distinguish moderate from excessive drinking, a value of 30 pg/mg of EtG, and 0.5 ng/mg (for 0-3 cm segments) or 1.0 ng/mg (for 0-6 cm segments) of FAEEs was used. At the proposed cut-off values, EtG presented good sensitivity (60-81.6%) and specificity (56.3–90.3%), while for FAEEs good specificity was obtained (87.5–100%), but sensitivity varied between 30.5% and 100%. In order to verify if the currently proposed cut-off values are adequate for the studied population, receiver operating characteristic (ROC) analysis was performed, to determine the optimal cut-offs based on the results. Optimal EtG cut-off concentrations were determined to be 7.30 and 29.85 pg/mg, respectively for abstinence and excessive drinking, which are similar to those proposed by the SoHT. For FAEEs, optimal concentrations were 0.185 and 0.378 ng/mg for abstinence, at 0–3 cm and 0–6 cm hair segments, respectively, both similar to the proposed values. At the cut-off for excessive drinking, similar cut-off values were obtained for both lengths (0.817 and 0.889 ng/mg), but these are not similar to the proposed values. However, they confirm that harmonization of the excessive drinking cut-off value for FAEEs can be possible, at a concentration close to 0.8 ng/mg, regardless the length of the hair segment. The use of hair washing products, such as hair conditioner and mask, was found to be associated with lower concentrations of EtG in hair. Cosmetic treatments as bleaching and/or dyeing were associated with the same effect. No effect was associated with the use of hairspray, gel or wax, and for the FAEEs there was no observable effect associated with any of the mentioned products. This demonstrates the importance of documenting the use of hair washing products and cosmetic treatments during sample collection, and the high care that must be taken during result interpretation, considering this information when positivity or negativity for a hair sample is to be given. Both biomarkers correlated with the self-reported consumption habit, while only EtG correlated with the ingested quantities of alcohol per occasion. Inconclusive cases were obtained during combined interpretation of EtG and FAEEs. These cases could mostly be explained by the use of hair products and cosmetic treatments; however, in a number of cases where no simple explanation could be presented, the results of EtG analysis were in agreement with the questionnaire data. This indicates that EtG should be regarded as the first choice in alcohol consumption assessment, while FAEEs should be used to confirm the results from EtG analysis. Only 56.3% of the self-reported abstinent cases could be confirmed by combined analysis of EtG and FAEEs; for moderate drinkers this percentage was 71.6% and for excessive drinkers 60%. Alcohol consumption underestimation or overestimation are assumed as major reasons for this percentages. Combined alcohol biomarker analysis showed that the student population is majorly composed of moderate drinkers (69.39%), followed by abstinent (18.82%) and excessive drinkers (11.69%). Overall, hair analysis for alcohol biomarkers proved to be a powerful tool for the assessment of alcohol consumption in a student population, with considerable advantages. Hair is a sample easy to collect through non-evasive manners, easily stored and the chances of adulteration are low. Therefore, it has good potential to be applied in population studies, especially because it can complete and confirm a great part of the information obtained by questionnaire analysis with added reliability, promoting as such sound and defensible results. | pt_PT |
| dc.description.abstract | O álcool é a substância psicoativa mais consumida a nível mundial, e o seu consumo representa um problema de saúde crescente em diversos países. O consumo de álcool na população jovem é bastante comum, com particular destaque e incidência nos estudantes universitários. Deste modo, a população estudantil é considerada como um grupo de risco, no qual o consumo de álcool é associado a baixas performances a nível intelectual. O consumo excessivo de álcool pode ainda provocar diversos comportamentos de risco, nomeadamente sexo não planeado e não seguro, violência sexual e de outras naturezas, danos materiais e condução rodoviária irresponsável. Desta forma, a monitorização do consumo de álcool na população estudantil é fundamental para avaliar o panorama dos hábitos de consumo, bem como identificar tendências emergentes, permitindo a implementação de políticas de combate e avaliação da respetiva eficácia. O consumo de álcool é frequentemente avaliado por estudos de inquérito, que recorrem à análise estatística de resultados obtidos através de questionários. Este método, apesar de possibilitar a recolha de uma vasta informação, apresenta algumas limitações, nomeadamente em relação à veracidade da informação recolhida, dado que o participante é passível de exagerar ou inclusivamente mentir nas respostas fornecidas. Assim, e de modo a obter resultados verdadeiros, é fundamental o recurso a outras ferramentas. O uso de métodos analíticos para determinação de biomarcadores de álcool em amostras biológicas assume grande interesse no contexto clínico e forense, podendo ainda ser usados como confirmação de dados obtidos através de questionários. Um biomarcador de álcool é uma substância passível de ser mensurável, e a sua presença na matriz biológica é normalmente indicativa de exposição. Nos últimos anos, o cabelo tem sido uma matriz amplamente estudada, com inúmeras vantagens, nomeadamente a sua fácil recolha por métodos não-invasivos, apresenta uma larga janela de deteção e é difícil de adulterar. A monitorização da exposição ao álcool através da análise de cabelo incide fundamentalmente em dois biomarcadores, o etil glucuronido (EtG) e os ésteres etílicos dos ácidos gordos (FAEEs). Estes dois marcadores têm sido usados em diversos estudos nos últimos anos, e apresentam boa sensibilidade e especificidade. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o consumo de álcool na população estudantil universitária portuguesa com recurso a dois métodos: questionários de autopreenchimento e determinação analítica de biomarcadores de consumo de álcool (EtG e FAEEs) em amostras de cabelo. A população foi equitativamente distribuída por 9 universidades portuguesas, 1192 amostras de cabelo foram recolhidas bem como os respetivos questionários. Em 975 amostras foi possível proceder à análise e determinação dos biomarcadores de álcool pelos métodos analíticos desenvolvidos. Os resultados dos questionários indicam que a idade de início de consumo de álcool se situa entre os 12 e os 18 anos, sendo que a maioria admite ter iniciado o consumo aos 15 anos. Em relação aos hábitos de consumo, os estudantes consideram o seu consumo como moderado, enquanto cerca de um terço da população assume ter consumido álcool em excesso no último mês. A bebida mais consumida é a cerveja, e a grande maioria prefere beber acompanhado e em locais públicos, como café-bar. Ao género masculino está associada uma ingestão de maiores quantidades de álcool por ocasião, contudo ambos os géneros apresentaram volumes de álcool indicativos de consumo de risco e excessivo. Nos questionários foi ainda recolhida informação sobre o consumo de outras substâncias, nomeadamente tabaco e substâncias ilícitas, e tendo aproximadamente um terço da população admitido o uso destas substâncias, com maior incidência no género masculino. A canábis é a substância ilícita mais consumida, sendo que maioria da população admite consumi-la raramente, contudo 50% dos participantes admitem utilizar substâncias ilícitas em conjunto com o álcool. Tendo em conta as características físico-químicas dos biomarcadores de álcool, EtG e FAEES, foram desenvolvidos e otimizados dois métodos analíticos. Para a análise do EtG, a amostra de cabelo foi sujeita a ultra-sonicação em água, para extração do composto da matriz, seguindose extração em fase sólida (SPE) e análise por cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Relativamente aos FAEEs, foram analisados quatro compostos (miristato, palmitato, oleato e estearato de etilo), tendo os compostos sido extraídos do cabelo por incubação em heptano. Os extratos foram sujeitos a SPE e analisados por cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa em tandem (GC-MS/MS). Ambos os métodos analíticos foram validados de acordo com normas internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos, nomeadamente da Food and Drug Administration (FDA) e International Conference on Harmonization (ICH). Os parâmetros avaliados foram sensibilidade, limites, lineariadade, precisão e exatidão, recuperação, estabilidade e efeito matriz. Ambos os métodos mostraram ser seletivos, com limites de quantificação de 3 pg/mg, para o EtG, e de 30 pg/mg, para cada um dos FAEEs analisados. Os intervalos de linearidade situaram-se entre os 3–500 pg/mg e 30–5000 pg/mg, para o EtG e FAEEs, respetivamente. A precisão e exatidão revelaram ser aceitáveis de acordo com as normas utilizadas. A recuperação variou entre os 74,79% e os 97,90%, e as amostras processadas de EtG revelaram ser estáveis durante pelo menos 96h, enquanto que para os FAEEs foram estáveis pelo menos 24h. O efeito matriz foi apenas estudado para o EtG, não tendo sido considerado significativo. A análise das amostras de cabelo mostra que o género masculino apresenta maiores concentrações de ambos os biomarcadores, sendo que as universidades da Beira Interior e de Coimbra foi onde foram registadas as concentrações mais elevadas. Os participantes foram divididos de acordo com o tipo de consumo: abstinente, moderado e excessivo, consoante as concentrações de cut-off propostas pela Society of Hair Testing (SoHT) para cada biomarcador. Os valores propostos para distinguir consumo abstinente de moderado são de 7 pg/mg para o EtG, e de 0,2 ng/mg (para segmentos de 0-3 cm) ou 0,4 ng/mg (para segmentos de 0-6 cm) para os FAEEs. Para distinguir consumo moderado de excessivo, foi usado o valor de 30 pg/mg para o EtG, e 0,5 ng/mg (para segmentos de 0-3 cm) ou 1,0 ng/mg (para segmentos de 0-6 cm) de FAEEs. O EtG apresentou boa sensibilidade (60–81,6%) e especificidade (56,3–90,3%) para cada cut-off proposto; para os FAEEs foi obtida boa especificidade (87,5–100%), mas a sensibilidade foi muito variável, tendo oscilado entre 30,5% e 100%. Com o propósito de verificar se os cut-off atualmente propostos pela SoHT se adequam à população em estudo, foi elaborada análise através das curvas ROC (receiver operating characteristic), e com base nos resultados obtidos foram determinados valores de cut-off ótimos. Para o EtG, os valores determinados para o consumo abstinente e excessivo, foram de 7,30 e de 29,85 pg/mg, respetivamente. Para os FAEEs, a SoHT recomenda que seja tido em conta o comprimento do segmento do cabelo. Assim, os valores determinados para abstinência foram de 0,185 e de 0,378 ng/mg para os segmentos de 0-3 cm e 0-6 cm, respetivamente. No que respeita o consumo excessivo, foram obtidos valores semelhantes para os diferentes segmentos, de 0,817 e de 0,889 ng/mg, respetivamente. Os valores de consumo excessivo determinados para o EtG são similares aos propostos pela SoHT, contudo o mesmo não acontece para os FAEEs. Ainda assim, a proximidade dos valores obtidos para o consumo excessivo para estes compostos apoia a possibilidade de usar o mesmo valor de cut-off independentemente do comprimento do segmento analisado, considerando-se um valor de cerca de 0,8 ng/mg como adequado. Foi ainda possível avaliar se o uso de tratamentos e produtos cosméticos interferiam na determinação dos biomarcadores de álcool. Os resultados obtidos para o EtG mostraram que o uso de produtos de lavagem, tais como acondicionador e máscara, estão associados a concentrações mais baixas, assim como tratamentos cosméticos como descoloração e/ou pintura. Por outro lado, o uso de produtos como laca, gel ou cera não mostraram ter qualquer efeito associado. Não foi observado qualquer efeito associado a tratamentos ou produtos específicos no caso dos FAEEs. Ainda assim, estes resultados reforçam a necessidade e importância de documentar os hábitos de higiene (por exemplo, número de lavagens) bem como o uso de produtos e tratamentos cosméticos, aquando da recolha da amostra. Estas informações devem ainda ser tidas em consideração na interpretação dos resultados e os casos tratados com particular atenção. Tendo em conta os resultados para o EtG e FAEEs em combinação, foi possível verificar a existência de correlação entre a resposta nos questionários, em relação aos hábitos de consumo, e a concentração determinada para ambos os biomarcadores. Para o EtG, foi ainda possível encontrar correlação em relação às quantidades de álcool ingeridas por ocasião. Contudo, foram obtidos alguns casos inconclusivos durante a interpretação combinada de EtG e FAEEs. Em parte, isto pode ser justificado devido ao uso de produtos e tratamentos cosméticos, uma vez que estes podem influenciar a determinação dos biomarcadores em cabelo; contudo, não existe uma justificação simples para o elevado número de casos inconclusivos. Ainda assim, os resultados do EtG estavam em concordância com a informação recolhida nos questionários, o que reforça a ideia de que o EtG é um biomarcador mais fiável, devendo ser a primeira escolha para determinar o consumo álcool em amostras de cabelo, enquanto os FAEEs devem ser usados para confirmar os resultados da análise de EtG. A análise combinada de EtG e FAEEs mostra que a população estudantil é maioritariamente composta por consumidores moderados (69,39%), seguido de abstinentes (18,82%) e excessivos (11,69%). Contudo, a análise combinada dos biomarcadores apenas permitiu confirmar 56,3% dos casos de consumo abstinente reportado nos questionários, e 71,6% e 60 % para o consumo moderado e excessivo. Tendo em conta que os questionários são de autopreenchimento, os participantes são suscetíveis de subestimar ou sobrestimar os seus hábitos do consumo aquando do preenchimento, o que permite justificar os resultados obtidos. No geral, a análise de biomarcadores de álcool em cabelo mostrou ser uma poderosa ferramenta para a determinação de consumo de álcool na população estudantil. O cabelo é uma matriz que, para além de ser de fácil recolha, por métodos não-invasivos, é fácil de armazenar e difícil de adulterar. Por estes motivos, apresenta um grande potencial para ser aplicado a estudos populacionais, especialmente porque é capaz de completar e confirmar grande parte da informação obtida por questionários, com elevada veracidade. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | This project was financed by the Programa de investigação de saúde de 2012 (reference 125895) from the Fundação Calouste Gulbenkian. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101495706 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/4317 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Alcohol consumption | pt_PT |
| dc.subject | Student population | pt_PT |
| dc.subject | Alcohol biomarkers | pt_PT |
| dc.subject | Ethyl glucuronide | pt_PT |
| dc.subject | Fatty acid ethyl esters | pt_PT |
| dc.title | Hair analysis for alcohol biomarkers: assessing excessive consumption in a student population | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| person.familyName | Oppolzer | |
| person.givenName | David | |
| person.identifier.orcid | 0000-0002-8888-4976 | |
| person.identifier.scopus-author-id | 55623902200 | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
| relation.isAuthorOfPublication | 6fb520dc-95bc-4d6a-8f9e-a290865468f7 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | 6fb520dc-95bc-4d6a-8f9e-a290865468f7 | |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Bioquímica | pt_PT |