Publication
Biosynthesis of human membrane-bound Catechol-O-methyltransferase: optimization using Plackett-Burman and Central Composite Design
| datacite.subject.fos | CiĆŖncias MĆ©dicas::CiĆŖncias BiomĆ©dicas | |
| dc.contributor.advisor | Passarinha, LuĆs AntĆ³nio Paulino | |
| dc.contributor.author | Soares, Rui Filipe Lopes | |
| dc.date.accessioned | 2013-03-25T16:46:57Z | |
| dc.date.available | 2013-03-25T16:46:57Z | |
| dc.date.issued | 2012-06 | |
| dc.description.abstract | Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) is an S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase enzyme that catalyzes the methylation of catechol substrates (catecholamines, catecholestrogens). Physiologically, it is responsible for the elimination of biologically active or toxic catechols, making it a protein with great clinical relevance as therapeutic target in serious disorders, like schizophrenia and ParkinsonĀ“s disease. To fulfill pharmaceuticals requirements, new strategies of optimization and large-scale production of COMT enzyme are crucial. Statistical optimization approaches have demonstrated their enormous value in laboratory and industrial scale, namely in biotechnological production processes, in which an incremental enhancement can be a perpetual improvement. In this work, we aimed the optimization of recombinant human membrane-bound COMT (hMBCOMT) enzymatic activity yields following a statistical optimization as a solving approach. Plackett-Burman design was used as a first optimization step to identify which factors have a significant effect in hMBCOMT productivity and activity levels, and Response Surface Methodology (RSM), by a Central Composite Design (CCD), to optimize the process. We applied Brevibacillus choshinensis cells for the biosynthesis of hMBCOMT and a semi-defined medium for cell growth. This medium was subjected to a first screening using the PlackettāBurman design to evaluate the influence of the culture parameters (chemicals and physicals) in hMBCOMT enzymatic activity levels. Enzymatic activity were measured in a high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to a coulochemical detector. Among the eleven variables tested, polypeptone, ammonium sulfate, glucose and temperature were selected owing to their significant effect on human MBCOMT enzymatic activity. The biological human MBCOMT activity obtained with the semi-defined medium in Plackett-Burman design were very promising, while were higher than the obtained with 2SYNm medium, a traditional growth medium for Brevibacillus cells of this work. Typically, we obtained values of 93nmol/h for hMBCOMT total enzymatic activity and 30 nmol/h/mg of specific activity with protein in its native form, without the use of any kind of detergents on protein solubilization step. Based on the results of PlackettāBurman design, a CCD was adopted to define optimal components concentration and temperature in order to maximize our response. The CCD model presented a multiple correlation coefficient value of 0.635 and a significant lack of fit, showing the lack aptness of the model to the process optimization and the failure to attain the optimal concentration of each variable. | por |
| dc.description.abstract | Catecol-O-metiltransferase (COMT, CE 2.1.1.6) Ć© uma enzima metiltransferase dependente de S-adenosil-L-metionina (SAM) que catalisa a metilaĆ§Ć£o de substratos catecĆ³is (catecolaminas, catecolestrogĆ©nios). Fisiologicamente, Ć© responsĆ”vel pela eliminaĆ§Ć£o de catecĆ³is biologicamente activos ou tĆ³xicos, tornando-a uma proteĆna de elevado interesse clĆnico e utilizada como alvo terapĆŖutico em doenƧas graves, como a esquizofrenia e a doenƧa de Parkinson. Para suprir as necessidades farmacĆŖuticas, novas estratĆ©gias de otimizaĆ§Ć£o e produĆ§Ć£o em larga escala desta enzima sĆ£o fundamentais. Abordagens de otimizaĆ§Ć£o estatĆstica tĆŖm demonstrado o seu enorme valor Ć escala laboratorial e industrial, nomeadamente nos processos de produĆ§Ć£o biotecnolĆ³gicos, em que um pequeno detalhe melhorado pode significar um grande passo para o sucesso. Neste trabalho, objetivou-se a otimizaĆ§Ć£o do nĆvel de atividade enzimĆ”tica da proteĆna recombinante COMT, na sua forma membranar, atravĆ©s do recurso a modelos de otimizaĆ§Ć£o estatĆstica como uma abordagem resolutiva. Numa primeira fase de otimizaĆ§Ć£o e de seleĆ§Ć£o dos fatores mais significativos para a atividade enzimĆ”tica da proteĆna em estudo foi utilizada a tĆ©cnica de desenho experimental Plackett-Burman. ApĆ³s esta seleĆ§Ć£o foi aplicada a Metodologia de SuperfĆcie de Resposta (RSM), atravĆ©s de desenho composto central (DCC), para otimizaĆ§Ć£o da concentraĆ§Ć£o dos fatores que revelaram ser mais significativos e, consequentemente, do processo. Foi utilizado o sistema de expressĆ£o Brevibacillus choshinensis para a biossĆntese da proteĆna membranar COMT e um meio semi-definido para o seu crescimento. Este meio foi submetido a uma primeira triagem atravĆ©s do desenho experimental Plackett-Burman, avaliando-se desta forma a influĆŖncia dos parĆ¢metros de cultura (produtos quĆmicos e fĆsicos) nos nĆveis de actividade enzimĆ”tica da COMT membranar. Os nĆveis de actividade enzimĆ”tica foram medidos num sistema de cromatografia lĆquida de alta eficiĆŖncia acoplado a um detector amperomĆ©trico. Entre as onze variĆ”veis testadas, a polipeptona, sulfato de amĆ³nio, glucose e temperatura foram as variĆ”veis selecionadas dado o seu significativo efeito na actividade enzimĆ”tica da COMT membranar. Os nĆveis de atividade enzimĆ”tica obtidos nesta primeira triagem revelaram-se bastante promissores, sendo mais elevados do que os obtidos com o meio 2SYNm, meio de crescimento mais comum para as cĆ©lulas usadas neste trabalho. Foram obtidos valores de 93nmol/h para a actividade enzimĆ”tica total e cerca 30 nmol/h/mg de actividade enzimĆ”tica especĆfica com a proteĆna na sua forma nativa, sem o uso de qualquer tipo de detergentes no processo de solubilizaĆ§Ć£o. Com base nos resultados do desenho Plackett Burman foi aplicado o desenho Composto Central para a otimizaĆ§Ć£o dos quatro fatores em causa a fim de maximizar a nossa resposta. Este apresentou um valor do coeficiente de correlaĆ§Ć£o mĆŗltipla de 0,635 e uma falta de ajuste significativa, demonstrando a falta de adequaĆ§Ć£o do modelo para a otimizaĆ§Ć£o do processo. | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/1120 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.peerreviewed | yes | por |
| dc.publisher | Universidade da Beira Interior | por |
| dc.subject | DoenƧa de Parkinson | por |
| dc.subject | COMT membranar humana | por |
| dc.subject | Desenho Plackett-Burman | por |
| dc.subject | COMT (Catechol-O-methyltransferase) | por |
| dc.subject | ProteĆna Catechol-O-metiltransferase | por |
| dc.title | Biosynthesis of human membrane-bound Catechol-O-methyltransferase: optimization using Plackett-Burman and Central Composite Design | por |
| dc.title.alternative | BiossĆntese da proteĆna Catecol-O-metiltransferase membranar humana: optimizaĆ§Ć£o com recurso a desenho experimental Plackett-Burman e composto central | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.citation.conferencePlace | CovilhĆ£ | por |
| person.familyName | Lopes Soares | |
| person.givenName | Rui Filipe | |
| person.identifier.orcid | 0000-0001-8730-5584 | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| relation.isAuthorOfPublication | ec2a7483-2b34-448c-ae3e-da9991926a4a | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | ec2a7483-2b34-448c-ae3e-da9991926a4a |