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Abstract(s)
Traditionally, the central nervous system (CNS) is described as an immune-privileged
site that receives limited immune surveillance by peripheral lymphocytes under
physiological conditions. The discovery of the CNS lymphatic system suggests that the
CNS is an immune competent organ, closely interacting with the systemic immune
compartment under physiological conditions, in which almost all pathological changes
in the CNS elicit a prominent inflammatory reaction.
Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the CNS which affects the
white and gray matter. MS is believed to be an autoimmune disorder, but the antigen
specificity of the immune response is unknown. The pathological hallmark of chronic
MS is demyelinated plaque or lesions, which results from an attack on the CNS by
immune cells, relative preservation of axons, and the formation of astrocytic scars.
Complex multifactorial factors are implicated, in which the environmental are
hypothesized to interact with genetically susceptible individuals. In Portugal it is
estimated that around 5000 people are affected with MS.
The notion that MS is primarily a CD4+ T cell-mediated disease arises from the
similarities between the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and MS,
including the fact that T lymphocytes greatly outnumber B lymphocytes within MS
lesions.
Diagnosis of MS depends on clinical and paraclinical exams; there is no single
diagnostic test to recognize the disease. 85% of patients present a relapse-remitting
(RR) MS form, characterized by discrete episodes of neurological dysfunction (relapses
or exacerbations) separated by clinical stable periods with lack of disease progression
(remissions).
Interferon (IFN)-β is the most widely prescribed treatment for MS. IFN-β is a highly
pleiotropic cytokine which antagonizes the proinflammatory milieu by increasing
production of anti-inflammatory factors. It inhibits leukocyte trafficking and regulates
expression of the adhesion molecule. The mechanism of action of IFN-β is complex and
multifactorial but has been shown to reduce the biological activity of RRMS in several
clinical class I trials.
CNS tissue is difficult to access and immune responses within this tissue cannot be
easily monitored. Peripheral blood seems to mirror the immunological disturbances that underlie MS, which could represent the migration patterns between the periphery
and other tissues according to the clinical phase of the disease.
Based on this assumption, the main aim of this thesis was to characterize the
circulating immune cell populations of RRMS patients submitted to IFN-β treatment in
remission and relapse phases of the disease and compared with healthy subjects.
Several studies point to significant alterations in peripheral blood homeostasis of
different subpopulations of T cells, like γδ T cells or T helper (Th) 1, Th2, Th17 and T
cytotoxic (Tc) 1, Tc2, Tc17 functional subsets; of B cells subpopulations; and of innate
cells like monocytes and dendritic cells (DCs).
First, we started with the selection of the RRMS patients and collected blood from each
one after an informed consent was signed. Through direct immunofluorescence
membrane and intracytoplasmic staining protocols, by flow cytometry, were identified
and characterized the circulating cell subsets. For the functional assessment of the cells
intracellular cytokines at single cell level were measured after in vitro stimulation. To
evaluate gene expression, RNA isolation and quantitative real-time reverse
transcriptase-polymerase chain reaction was performed.
The systemic circulation of IFN-β-treated RRMS patients in remission showed lower
frequency of the (myeloid dendritic cells) mDCs subset and higher frequency in the
relapse phase, while the frequency of the (plasmacytoid dendritic cells) pDCs subset
remains unchanged. Consequently, the mDCs/pDCs ratio decreases in remission and
increases in relapse episodes. In remission RRMS patients, the DCs subsets increased
their capability to interact with T cells revealed through the increased expression of the
HLA-DR and decreased in relapse episodes. In RRMS, the mDCs/pDCs ratio and the
activation status of both DCs subsets constitutes a good peripheral biomarker between
phases.
In circulation of remission RRMS patients, the total monocyte cells and intermediate
monocyte (iMo) subset increased and the non-classical monocyte (ncMo) subset
decreased. In the relapse phase, the ncMo subset remains decreased. The monocyte
subsets present the same pattern of the expression of HLA-DR as the DCs subsets,
increasing in remission and decreasing in relapse.
The frequency of immature/transitional B cells increases in circulation of remission
IFN-β treated RRMS patients. Inside the memory B cell subsets, there was an increase
in CD27− B cell subset, more precisely the CD27−IgG+ cells, and a decrease in
CD27−IgA+ cells. Relapse RRMS patients showed lower total B cells when compared
with remission phase patients, accompanied by an increase in the CD27- memory B cell phases were the increase in the plasmablast B cell subset. The ratio between
immature/transitional B cells and plasmablasts decreased in relapse when compared
with remission RRMS.
The T cell subsets exhibit a shift toward Th2 and Tc2 polarization with a reduction of
the Th1 and Tc1 functional subset, in remission episodes. This is accompanied by a
reduction in the production of proinflammatory cytokines, mainly IFNγ. Conversely,
the frequency of the Th17, Tc17 subsets and the serum level of IL17 increased. In the
relapse phase, the Th17 subset decreases the cytokines produced, while the Tc17 subset
maintains high levels of tumor necrosis factor (TNF)-α production.
The signature of cytokines produced by Th(c)1 and Th(c)17 cells was different. The
present study demonstrates that the action mode of IFN-β on Th(c)1 and Th(c)17 cells
promotes different results in systemic circulation of RRMS patients. IFN-β therapy
supports the decrease in pro-inflammatory cytokines produced by Th(c)1 cells and
increase the production of pro-inflammatory cytokines by the Th(c)17. Th17 subset
perpetuates and promote the chronic inflammation in periphery in remission RRMS
patients, through the production of IL-17 and Th1 type cytokines.
No differences were found between the frequency of regulatory T and T follicular helper
-like subsets. However, CXCR5+CD4+T cells exhibit a more proinflammatory activity,
presenting higher frequencies of TNF-α+ cells in both phases of RRMS. CXCR5+CD8+T
cells exhibited an increased ability to produce IL-2 (assuming a Th1 profile) in the
remission phase of the disease, thus decreasing in relapsing episodes.
The frequency of γδ T cells was the same between healthy subjects and RRMS patients.
In remission phase, the central memory γδ T (TCM) subset decreased, and the naive
compartment increased. In relapse RRMS patients, the terminally differentiated
effector memory γδ T (TEMRA) subset decreased when compared with remission
episodes. CCR5+ γδ TEMRA cells were significantly depleted, as a consequence of the
migratory pattern in order to play effector functions. This subset presents as a possible
participator in the demyelination process and an attractive peripheral blood biomarker
between RRMS phases.
The identification and characterization of circulating cells can contribute to clarify the
pathophysiology of MS, their progression, and the function of each subset in this
process. Some of the more relevant results obtained in this study could have the
potential to be considered as peripheral biomarkers between remission and relapse
RRMS patients treated with IFN-β, namely: the mDCs/pDCs ratio, the activation profile of DCs and monocyte subsets, the commitment of the Th17 cells with a Th1
signature, the CCR5+γδTEMRA cell subset and the ratio between immature/transitional B
cells and plasmablasts.
In both phases of RRMS, the ncMo subset was decreased and the IgM+CD27+ memory
B cells and the compartment CD27- memory B cells increased in RRMS patients.
The identification of peripheral markers that could reflect the clinical course of MS and
the efficacy of treatment is a stimulating field of research and debate. In the future,
further studies including larger cohorts of patients and a larger follow-up are needed in
order to establish whether this immune shift correlates with a favorable clinical
response.
Tradicionalmente, o sistema nervoso central (SNC) é descrito como um tecido com privilégio imunitário que em condições fisiológicas é sujeito a uma vigilância imunológica limitada por linfócitos periféricos. A descoberta do sistema linfático do SNC sugere que este é um órgão imunocompetente, interagindo intimamente com o sistema imunitário sistêmico e quase todas as alterações patológicas no SNC desencadeiam uma reação inflamatória proeminente. A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do SNC que afeta a substância branca e cinzenta, apesar de ser uma doença auto-imune desconhece-se o antigénio que desencadeia a resposta imune. As placas ou lesões desmielinizantes que resultam de um ataque ao SNC por células imunes, a preservação relativa dos axônios e a formação de cicatrizes astrocíticas são as características patológicas da EM. Na origem da patologia supõe-se que estejam fatores multifatoriais complexos, nos quais características ambientais interajam com indivíduos geneticamente suscetíveis. Em Portugal estima-se que cerca de 5000 pessoas sejam afetadas pela EM. A noção de que a EM é principalmente uma doença mediada por linfócitos T CD4+ surge das semelhanças entre o modelo animal, encefalomielite autoimune experimental (EAE), e a EM, incluindo o facto de que o número de linfócitos T supera em muito os linfócitos B nas lesões da EM. O diagnóstico da EM baseia-se em exames clínicos e paraclínicos; não existe um único teste diagnóstico para identificar a doença. 85% dos doentes apresentam a forma de EM surto-remissão (SR), caracterizada por episódios discretos de disfunção neurológica (exacerbações ou surtos) separados por períodos clínicos estáveis com ausência de progressão da doença (remissões). O interferão (IFN)-β é o tratamento mais prescrito para a EM. O IFN-β é uma citocina pleiotrópica que antagoniza o meio pró-inflamatório ao aumentar a produção de citocinas anti-inflamatórios, regular a migração dos leucócitos e a expressão de moléculas de adesão. O mecanismo de ação do IFN-β é complexo e multifatorial, no entanto, em vários ensaios clínicos de classe I foi demonstrado que reduz a atividade biológica da EMSR. O SNC é de difícil acesso, assim como a avaliação das respostas imunes neste tecido. O sangue periférico parece refletir as alterações imunológicos que estão por trás da EM, tal como o padrão de migração entre a periferia e outros tecidos de acordo com a fase clínica da doença. Com base neste pressuposto, o objetivo principal desta tese foi caracterizar as células circulantes do sistema imunitário nas fases de remissão e surto de doentes com EMSR tratados com IFN-β, em comparação com indivíduos saudáveis. Vários estudos referem alterações significativas na homeostase de diferentes subpopulações de células T, como os linfócitos γδ ou subconjuntos funcionais T helper (Th)1, Th2 e Th17; de subpopulações de células B; e de células do sistema inato como monócitos e células dendríticas. Numa fase inicial foram selecionados os doentes com EMSR. Após assinatura do termo de consentimento livre na participação do trabalho foi colhido sangue periférico. Por citometria de fluxo, através de protocolos de marcação de membrana e intracitoplasmática foram identificadas e caracterizadas as subpopulações circulantes. Para avaliação funcional das células, após estimulação in vitro foram avaliadas as citocinas intracelulares produzidas. Com o intuito de avaliar a expressão gênica foi isolado RNA e realizada a reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa quantitativa em tempo real. Nos doentes com EMSR tratados com IFN-β observou-se uma diminuição das células dendríticas mieloides (mDCs) em remissão e um aumento na fase de surto, enquanto a frequência das células dendríticas plasmocitóides (pDCs) permaneceu inalterada. Consequentemente, a proporção mDCs/pDCs diminuiu na remissão e aumentou nos episódios de surto. As células dendríticas (DCs) aumentaram a sua capacidade de interagir com os linfócitos T, revelado pelo aumento da expressão do HLA-DR, em remissão e diminuição em surto. A razão mDCs/pDCs e a ativação das subpopulações de DCs podem constituir um bom biomarcador periférico entre as fases da EMSR. Os monócitos totais e a subpopulação de monócitos intermédios (iMo) aumentaram na circulação de doentes com EMSR em remissão, enquanto a subpopulação de monócitos não-clássicos (ncMo) diminuiu, mantendo-se diminuída em surto. As subpopulações de monócitos apresentam o mesmo padrão de expressão de HLA-DR que as DCs, aumentam em remissão e diminuem em surto. Os monócitos submetidos ao IFN-β promovem a produção de citocinas anti-inflamatórias por parte dos linfócitos T; isto é descrito como um efeito imunomodulador positivo da terapia. Em remissão, a subpopulação de B imaturas/transicionais aumenta. Dentro das células B de memória, a subpopulação de memória B CD27−aumentou, mais precisamente as células CD27−IgG+ e diminui a subpopulação memória B CD27−IgA+. Os doentes em surto apresentaram os linfócitos B totais diminuídos quando comparados com doentes em remissão, acompanhada por um aumento da subpopulação de células B de memória CD27-, conforme descrito para a fase de remissão. A principal diferença entre as fases de EMSR foi o aumento da subpopulação de plasmablasto. A proporção entre células B imaturas/transicionais e plasmablastos diminuiu no surto quando comparada com EMSR em remissão. Relativamente aos linfócitos T, estes promovem a polarização nas subpopulações Th2 e Tc2 com uma redução das subpopulações Th1 e Tc1, em episódios de remissão. Simultaneamente observou-se uma redução na produção de citocinas próinflamatórias, principalmente IFNγ. A frequência das subpopulações Th17, Tc17 e o nível sérico de IL17 aumentaram. Na fase de surto, a subpopulação Th17 diminui as citocinas produzidas, enquanto a Tc17 mantém elevados níveis de produção de TNF-α. As subpopulações Th(c)1 e Th(c)17 circulantes produziram citocinas diferentes. O presente estudo demonstra que o modo de ação do IFN-β nas células Th(c)1 e Th(c)17 promove resultados diferentes na circulação sistêmica de doentes com EMSR. O IFN-β diminui a produção de citocinas pró-inflamatórias produzidas pelas células Th(c)1 e aumenta a produção de citocinas pró-inflamatórias pelas Th(c)17. A subpopulação Th17 perpetua e promove a inflamação crônica na periferia em doentes em remissão, por meio da produção de IL-17 e de citocinas tipo Th1. Entre a frequência das subpopulações de linfócitos T reguladores e T helper foliculares não foram encontradas diferenças. No entanto, as células T CD4+CXCR5+ exibem uma maior atividade pró-inflamatória, apresentando frequências mais elevadas de TNF-α+ em ambas as fases da EMSR. As células T CD8+CXCR5+ exibiram uma capacidade aumentada de produzir IL-2 (assumindo um perfil Th1) na fase de remissão da doença, diminuindo em surto. A frequência das células T γδ foi a mesma entre indivíduos saudáveis e doentes com EMSR. No entanto, nos compartimentos imunológicos, a subpopulação Tγδ memória central (TCM) diminuiu e a naive aumentou, em fase de remissão. Em surto, a subpopulação Tγδ memória efetora terminalmente diferenciada (TEMRA) diminuiu quando comparada com doentes em remissão. As células CCR5+ Tγδ EMRA encontram-se significativamente diminuídas, saindo da circulação sistémica de forma a desempenhar funções efectoras. Esta subpopulação apresenta-se como um possível participante no processo de desmielinização e um bom biomarcador de sangue periférico entre as fases de EMSR. A identificação e caracterização das células imunitárias circulantes podem esclarecer a fisiopatologia da EM, sua progressão e a função de cada subpopulação neste processo. Algumas subpopulações podem ser consideradas potenciais biomarcadores periféricos entre doentes com EMSR em remissão e surto tratados com IFN-β: tais como a razão mDCs/pDCs, o perfil de ativação das DCs e dos monócitos, o comprometimento das células Th17 com uma assinatura Th1, a subpopulação CCR5+ Tγδ EMRA e a razão entre células B imaturas/transicionais e plasmablastos. Em ambas as fases da EMSR, a subpopulação ncMo diminui e as células B de memória CD27+IgM+e CD27- aumentaram em doentes com EMSR. A identificação de marcadores periféricos pode refletir o curso clínico da EM e a eficácia do tratamento. No futuro são necessários mais estudos, incluindo maiores números de doentes de forma a estabelecer a correlação entre as alterações observadas no sistema imune periférico e a resposta clínica.
Tradicionalmente, o sistema nervoso central (SNC) é descrito como um tecido com privilégio imunitário que em condições fisiológicas é sujeito a uma vigilância imunológica limitada por linfócitos periféricos. A descoberta do sistema linfático do SNC sugere que este é um órgão imunocompetente, interagindo intimamente com o sistema imunitário sistêmico e quase todas as alterações patológicas no SNC desencadeiam uma reação inflamatória proeminente. A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do SNC que afeta a substância branca e cinzenta, apesar de ser uma doença auto-imune desconhece-se o antigénio que desencadeia a resposta imune. As placas ou lesões desmielinizantes que resultam de um ataque ao SNC por células imunes, a preservação relativa dos axônios e a formação de cicatrizes astrocíticas são as características patológicas da EM. Na origem da patologia supõe-se que estejam fatores multifatoriais complexos, nos quais características ambientais interajam com indivíduos geneticamente suscetíveis. Em Portugal estima-se que cerca de 5000 pessoas sejam afetadas pela EM. A noção de que a EM é principalmente uma doença mediada por linfócitos T CD4+ surge das semelhanças entre o modelo animal, encefalomielite autoimune experimental (EAE), e a EM, incluindo o facto de que o número de linfócitos T supera em muito os linfócitos B nas lesões da EM. O diagnóstico da EM baseia-se em exames clínicos e paraclínicos; não existe um único teste diagnóstico para identificar a doença. 85% dos doentes apresentam a forma de EM surto-remissão (SR), caracterizada por episódios discretos de disfunção neurológica (exacerbações ou surtos) separados por períodos clínicos estáveis com ausência de progressão da doença (remissões). O interferão (IFN)-β é o tratamento mais prescrito para a EM. O IFN-β é uma citocina pleiotrópica que antagoniza o meio pró-inflamatório ao aumentar a produção de citocinas anti-inflamatórios, regular a migração dos leucócitos e a expressão de moléculas de adesão. O mecanismo de ação do IFN-β é complexo e multifatorial, no entanto, em vários ensaios clínicos de classe I foi demonstrado que reduz a atividade biológica da EMSR. O SNC é de difícil acesso, assim como a avaliação das respostas imunes neste tecido. O sangue periférico parece refletir as alterações imunológicos que estão por trás da EM, tal como o padrão de migração entre a periferia e outros tecidos de acordo com a fase clínica da doença. Com base neste pressuposto, o objetivo principal desta tese foi caracterizar as células circulantes do sistema imunitário nas fases de remissão e surto de doentes com EMSR tratados com IFN-β, em comparação com indivíduos saudáveis. Vários estudos referem alterações significativas na homeostase de diferentes subpopulações de células T, como os linfócitos γδ ou subconjuntos funcionais T helper (Th)1, Th2 e Th17; de subpopulações de células B; e de células do sistema inato como monócitos e células dendríticas. Numa fase inicial foram selecionados os doentes com EMSR. Após assinatura do termo de consentimento livre na participação do trabalho foi colhido sangue periférico. Por citometria de fluxo, através de protocolos de marcação de membrana e intracitoplasmática foram identificadas e caracterizadas as subpopulações circulantes. Para avaliação funcional das células, após estimulação in vitro foram avaliadas as citocinas intracelulares produzidas. Com o intuito de avaliar a expressão gênica foi isolado RNA e realizada a reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa quantitativa em tempo real. Nos doentes com EMSR tratados com IFN-β observou-se uma diminuição das células dendríticas mieloides (mDCs) em remissão e um aumento na fase de surto, enquanto a frequência das células dendríticas plasmocitóides (pDCs) permaneceu inalterada. Consequentemente, a proporção mDCs/pDCs diminuiu na remissão e aumentou nos episódios de surto. As células dendríticas (DCs) aumentaram a sua capacidade de interagir com os linfócitos T, revelado pelo aumento da expressão do HLA-DR, em remissão e diminuição em surto. A razão mDCs/pDCs e a ativação das subpopulações de DCs podem constituir um bom biomarcador periférico entre as fases da EMSR. Os monócitos totais e a subpopulação de monócitos intermédios (iMo) aumentaram na circulação de doentes com EMSR em remissão, enquanto a subpopulação de monócitos não-clássicos (ncMo) diminuiu, mantendo-se diminuída em surto. As subpopulações de monócitos apresentam o mesmo padrão de expressão de HLA-DR que as DCs, aumentam em remissão e diminuem em surto. Os monócitos submetidos ao IFN-β promovem a produção de citocinas anti-inflamatórias por parte dos linfócitos T; isto é descrito como um efeito imunomodulador positivo da terapia. Em remissão, a subpopulação de B imaturas/transicionais aumenta. Dentro das células B de memória, a subpopulação de memória B CD27−aumentou, mais precisamente as células CD27−IgG+ e diminui a subpopulação memória B CD27−IgA+. Os doentes em surto apresentaram os linfócitos B totais diminuídos quando comparados com doentes em remissão, acompanhada por um aumento da subpopulação de células B de memória CD27-, conforme descrito para a fase de remissão. A principal diferença entre as fases de EMSR foi o aumento da subpopulação de plasmablasto. A proporção entre células B imaturas/transicionais e plasmablastos diminuiu no surto quando comparada com EMSR em remissão. Relativamente aos linfócitos T, estes promovem a polarização nas subpopulações Th2 e Tc2 com uma redução das subpopulações Th1 e Tc1, em episódios de remissão. Simultaneamente observou-se uma redução na produção de citocinas próinflamatórias, principalmente IFNγ. A frequência das subpopulações Th17, Tc17 e o nível sérico de IL17 aumentaram. Na fase de surto, a subpopulação Th17 diminui as citocinas produzidas, enquanto a Tc17 mantém elevados níveis de produção de TNF-α. As subpopulações Th(c)1 e Th(c)17 circulantes produziram citocinas diferentes. O presente estudo demonstra que o modo de ação do IFN-β nas células Th(c)1 e Th(c)17 promove resultados diferentes na circulação sistêmica de doentes com EMSR. O IFN-β diminui a produção de citocinas pró-inflamatórias produzidas pelas células Th(c)1 e aumenta a produção de citocinas pró-inflamatórias pelas Th(c)17. A subpopulação Th17 perpetua e promove a inflamação crônica na periferia em doentes em remissão, por meio da produção de IL-17 e de citocinas tipo Th1. Entre a frequência das subpopulações de linfócitos T reguladores e T helper foliculares não foram encontradas diferenças. No entanto, as células T CD4+CXCR5+ exibem uma maior atividade pró-inflamatória, apresentando frequências mais elevadas de TNF-α+ em ambas as fases da EMSR. As células T CD8+CXCR5+ exibiram uma capacidade aumentada de produzir IL-2 (assumindo um perfil Th1) na fase de remissão da doença, diminuindo em surto. A frequência das células T γδ foi a mesma entre indivíduos saudáveis e doentes com EMSR. No entanto, nos compartimentos imunológicos, a subpopulação Tγδ memória central (TCM) diminuiu e a naive aumentou, em fase de remissão. Em surto, a subpopulação Tγδ memória efetora terminalmente diferenciada (TEMRA) diminuiu quando comparada com doentes em remissão. As células CCR5+ Tγδ EMRA encontram-se significativamente diminuídas, saindo da circulação sistémica de forma a desempenhar funções efectoras. Esta subpopulação apresenta-se como um possível participante no processo de desmielinização e um bom biomarcador de sangue periférico entre as fases de EMSR. A identificação e caracterização das células imunitárias circulantes podem esclarecer a fisiopatologia da EM, sua progressão e a função de cada subpopulação neste processo. Algumas subpopulações podem ser consideradas potenciais biomarcadores periféricos entre doentes com EMSR em remissão e surto tratados com IFN-β: tais como a razão mDCs/pDCs, o perfil de ativação das DCs e dos monócitos, o comprometimento das células Th17 com uma assinatura Th1, a subpopulação CCR5+ Tγδ EMRA e a razão entre células B imaturas/transicionais e plasmablastos. Em ambas as fases da EMSR, a subpopulação ncMo diminui e as células B de memória CD27+IgM+e CD27- aumentaram em doentes com EMSR. A identificação de marcadores periféricos pode refletir o curso clínico da EM e a eficácia do tratamento. No futuro são necessários mais estudos, incluindo maiores números de doentes de forma a estabelecer a correlação entre as alterações observadas no sistema imune periférico e a resposta clínica.
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Keywords
Esclerose múltipla surto-remissão Interferão-beta Célula dendrítica Monócito Linfócito T Linfócito B