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Publicação
The Bridge Between Nanotechnology and Chronobiology: Circadian Control of Cancer Therapy by Gene Delivery Systems
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Autores
Resumo(s)
Cancer is nowadays the second leading cause of death worldwide, making it a significant public health concern. Europe, following Asia, is, according to the Global Cancer Observatory (GLOBOCAN), the second continent where the incidence, mortality, and prevalence are highest. Statistics indicate that the number of cancer-related deaths in Europe is projected to increase 36.4% by 2050 compared to 2022. In particular, glioblastoma (GB), designated by the World Health Organization (WHO) as a grade 4 astrocytoma, represents the most prevalent (more than 50% of the total cases) and highly aggressive type of primary brain cancer in adults. This cancer is characterized by a high inter- and intratumourally genetic heterogeneity, aggressiveness, angiogenesis, invasiveness, resistance to current standard treatment protocols, poor patient prognosis (12-15 months), and low survival rate. Molecularly, several altered signalling pathways (p53 tumour suppressor pathway inclusive), gene mutations (tumour suppressor p53 gene (TP53), epidermal growth factor receptor (EGFR), isocitrate dehydrogenase (IDH)-1/2, etc.), and methylation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter contribute to its hyperproliferation, growth, and chemotherapeutic resistance. For these reasons, actual care treatments, as the classical Stupp protocol, face several challenges. This protocol focuses on first removing the tumour by surgical resection, without compromising the normal neurological function, followed by radiotherapy and chemotherapy with Temozolomide (TMZ), whose effectiveness depends on the MGMT gene promotor methylation status. However, after being subjected to this, patients prognosis remains very poor, and 90% of them have a tumour recurrence within two years. Thus, the development of new and more effective therapeutic approaches is essential to fight this disease. Innovative therapeutic strategies as nanotechnology, gene therapy, and chronotherapy, have been developed and explored to improve the treatment efficacy of GB. Gene therapy consists of delivering exogenous nucleic acids to cells to activate, silence, modify, or edit certain genes and correct genetic defects that may contribute to disease progression. In this case, correcting abnormal gene expression, since several mutations have been associated with glioblastoma, seems a promising approach to treat it. However, delivering nucleic acids to cells is difficult unless delivery systems are used. Nanotechnology, with the use of non-viral vectors (cell-penetrating peptides (CPPs), liposomes, polymers, exosomes, dendrimers, etc.), leads to ground-breaking possibilities for a precise delivery of anticancer drugs and nucleic acids to specific sites, overcoming several physiological barriers, as the blood-brain barrier (BBB). Targeting tumour-specific receptors using ligands at the delivery systems surface can minimize side effects and improve therapeutic responses. Additionally, in the past few years, the study of cancer cells circadian rhythms, normally disrupted, has shown that the circadian clock as a significant role in cancer development and therapeutic efficacy. Circadian rhythm is defined as the approximately 24 h oscillation of physiological and metabolic processes, which are synchronized with the Earth's diurnal cycle. Several studies indicated that rhythms could modulate drug’s effectiveness and their side effects, and delivery systems cellular uptake and efficacy. Studies have shown that some chemotherapy drugs are better tolerated or more effective at certain times of the day. Accordingly, the main object of this doctoral thesis was to design and develop a delivery system, functionalized to target glioblastoma cells, and to evaluate the influence of circadian rhythms on the efficacy of targeting, internalization, cargo release, and, ultimately, therapeutic effect for a precise cancer therapy strategy.
This approach focused on the use of a non-viral CPP, namely the WRAP5 peptide, for the construction of a delivery system bearing a transferrin (Tf) receptor ligand sequence (TfR) to co-deliver the anticancer TMZ drug and a plasmid DNA (pDNA) coding for p53 to glioblastoma cells. This system was designed to present an improved brain cell targeting ability and cellular uptake and to penetrate the brain barriers easily. The first step consisted of acquiring its physicochemical properties (size, polydisperse index, surface charge, and complexation capacity), morphology, and biocompatibility. Results revealed these properties to be under the influence of the N/P ratio, which can be optimized to improve complexes desired characteristics. These formulations demonstrated appropriate physicochemical characteristics for in vitro applications, and confocal microscopy using U87 glioblastoma cells confirmed their ability to internalize into cells and deliver the pDNA into the nucleus. Following nuclear localization, successful transcription and translation of the TP53 were observed. The resulting complexes significantly reduced the viability of glioblastoma cells. In a three-dimensional (3D) 9-day U87 spheroid model, generated by two different protocols, complexes were shown to have some effect on the spheroids morphology and size after a single dose treatment. Moreover, complexes have been revealed to be biocompatible with several non-cancerous cells and with zebrafish Danio rerio embryos. Experiments with other two glioma cell lines (SNB19 and U373) also highlighted the complexes ability for internalization and p53 expression levels increase. In these cell lines, apoptosis activation by the intrinsic pathway was implicated. This thesis also aimed to elucidate the influence of circadian core clock components in the performance of developed peptide nanocomplexes, namely, TfR expression, complexes internalization, and p53 expression promotion. The obtained results demonstrated that, at specific time-points, the highest circadian activity of Period circadian regulator 2 (PER2) and TfR led to higher cellular uptake of complexes, TP53 expression induction, and consequently p53 expression.
In summary, our comprehensive dataset provides strong evidence supporting the high potential of TMZ/TP53 co-delivery WRAP5 complexes for targeted cellular transfection, p53 expression, and for effectively triggering apoptotic pathways, holding promising therapeutic value toward glioblastoma. Moreover, aligning the timing of complexes administration with the circadian rhythms of GB cells may significantly enhance cellular uptake and gene/protein expression. This chronobiologically optimized approach offers a promising possibility for developing more precise and impactful treatment strategies against glioblastoma. Future preclinical research should prioritize the study of delivery systems bioavailability, tumour targeting, and pharmacokinetics at specific times of day in patient-derived 3D models and in vivo xenograft models. Additionally, it will be relevant to study the temporal expression of glioblastoma biomarkers and the effects of their knockout on survival and therapeutic outcomes. Understanding how brain barrier dynamics, such as permeability, for example, oscillate with circadian changes and impact delivery systems uptake, will bring noticeable improvements to this strategy. Ultimately, this research should instigate complexes clinical translation toward more effective glioblastoma therapy.
O cancro é atualmente a segunda principal causa de morte a nível mundial, constituindo uma preocupação significativa de saúde pública. A Europa, a seguir à Ásia, é, segundo o Observatório Mundial do Cancro (GLOBOCAN), o segundo continente com maior incidência, mortalidade e prevalência de casos. As estatísticas indicam que o número de mortes relacionadas com cancro na Europa deverá aumentar 36.4 % até 2050, em comparação a 2022. Em particular, o glioblastoma (GB), designado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um astrocitoma de grau 4, representa o tipo mais prevalente (mais de 50 % dos casos) e agressivo de cancro cerebral primário em adultos. Este tipo de cancro caracteriza-se por uma elevada heterogeneidade, agressividade, angiogénese, invasividade, resistência às terapias atualmente implementadas e baixa taxa de sobrevivência (12-15 meses). A nível molecular, diversos mecanismos contribuem para a sua proliferação exacerbada, crescimento e resistência terapêutica, incluindo vias de sinalização alteradas (como a via supressora de tumor p53), mutações genéticas (nomeadamente no gene supressor de tumor TP53, recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), isocitrato desidrogenase (IDH)1/2, entre outros), e metilação do promotor do gene da O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT). Por estas razões, os tratamentos atualmente disponíveis, como o protocolo clássico de Stupp, enfrentam várias limitações. Este protocolo baseia-se, numa primeira fase, na remoção cirúrgica do tumor, preservando a função neurológica normal, seguida de radioterapia e quimioterapia com Temozolomida (TMZ), cuja eficácia depende do estado de metilação do promotor do gene da MGMT. No entanto, mesmo após este tratamento, o prognóstico dos doentes permanece bastante reservado, com 90 % a apresentar recidiva tumoral num período de dois anos. Assim, o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais eficazes torna-se essencial no combate a esta doença. Estratégias terapêuticas inovadoras, como a nanotecnologia, a terapia génica e a cronoterapia, têm vindo a ser desenvolvidas e exploradas para melhorar a eficácia dos tratamentos do glioblastoma. A terapia génica consiste na entrega de ácidos nucleicos às células com o objetivo de ativar, silenciar, modificar ou editar determinados genes, corrigindo defeitos genéticos que possam contribuir para a progressão de uma determinada doença. Neste contexto, corrigir a expressão génica alterada, uma vez que várias mutações foram associadas ao glioblastoma, poderá ser uma abordagem promissora. No entanto, a entrega eficaz de ácidos nucleicos às células é desafiante sem o uso de sistemas de entrega. A nanotecnologia, através da utilização de vetores não virais (como péptidos penetradores de células, lipossomas, polímeros, exossomas, dendrímeros, entre outros), permite uma entrega precisa de fármacos anticancerígenos e ácidos nucleicos a locais específicos, superando várias barreiras fisiológicas, como a barreira hematoencefálica. A utilização de ligandos à superfície dos sistemas de entrega, capazes de reconhecer recetores tumorais específicos, pode minimizar os efeitos secundários e melhorar a resposta terapêutica. Recentemente, o estudo do ritmo circadiano das células cancerígenas, frequentemente desregulado, demonstrou que o relógio circadiano desempenha um papel relevante no desenvolvimento do cancro e na eficácia terapêutica. O ritmo circadiano define-se como uma oscilação aproximada de 24 horas dos processos fisiológicos e metabólicos, sincronizada com o ciclo diurno da Terra. Diversos estudos indicam que estes ritmos podem modular a eficácia e os efeitos secundários dos fármacos, bem como a internalização celular e eficácia dos sistemas de entrega. Foi demonstrado que alguns fármacos anticancerígenos são mais bem tolerados e mais eficazes a determinadas alturas do dia. Neste contexto, o principal objetivo desta tese de doutoramento foi desenhar e desenvolver um sistema de entrega funcionalizado, com direcionamento às células do glioblastoma, e avaliar a influência do ritmo circadiano na eficácia do direcionamento, internalização, libertação do fármaco e ADN plasmídico (pADN) e, em última análise, no efeito terapêutico, promovendo uma estratégia de tratamento oncológico precisa. Esta abordagem centrou-se na utilização do péptido WRAP5, para construir um sistema de entrega contendo um ligando para o recetor de transferrina, com o objetivo de co- entregar o fármaco anticancerígeno TMZ e um plasmídeo de ADN codificante para o gene supressor de tumor p53 a células do glioblastoma. Este sistema foi projetado para apresentar uma capacidade melhorada de direcionamento e internalização em células cerebrais, bem como de penetração na barreira hematoencefálica. O primeiro passo consistiu na caracterização das suas propriedades físico-químicas (tamanho, índice de polidispersidade, carga superficial e capacidade de complexação), morfologia e biocompatibilidade. Os resultados revelaram que estas propriedades são dependentes do rácio entre os grupos amina do péptido e os grupos fosfato do ADN, N/P, que pode ser otimizado para melhorar as características desejadas para os complexos. As formulações demonstraram propriedades físico-químicas adequadas para aplicações in vitro, e a microscopia de fluorescência com células U87, confirmou a sua capacidade de internalização e de entrega do pADN ao núcleo das células. Após a colocalização no núcleo das células, observou-se a transcrição e tradução da p53. Os complexos reduziram ainda significativamente a viabilidade das células do glioblastoma. Num modelo tridimensional (3D) de esferóides U87 de 9 dias, gerado por dois protocolos diferentes, os complexos demonstraram ter efeito na morfologia e tamanho dos esferóides após uma única administração. Além disso, os complexos mostraram ser biocompatíveis com várias células não cancerígenas e com embriões de peixe-zebra (Danio rerio). Experiências com outras duas linhas celulares de glioblastoma (SNB19 e U373) também evidenciaram a capacidade dos complexos em serem internalizados e induzirem a expressão da p53. Nestas linhas celulares, a ativação da apoptose envolveu a via intrínseca. Esta tese teve ainda como objetivo elucidar a influência dos componentes centrais do relógio circadiano na performance dos complexos peptídicos desenvolvidos, nomeadamente, na expressão do recetor de transferrina, na internalização dos complexos e na promoção da expressão da p53. Os resultados obtidos demonstraram que, em momentos específicos, a atividade circadiana mais elevada do regulador circadiano PER2 e do recetor de transferrina levaram a uma maior internalização celular dos complexos, indução da expressão do TP53 e consequentemente da expressão da p53. Em suma, o conjunto abrangente de dados obtidos nesta tese fornece evidências sólidas sobre o elevado potencial terapêutico dos complexos TMZ/WRAP5/TP53 para uma transfeção celular direcionada, expressão da p53 e ativação de vias apoptóticas. Esta abordagem apresenta-se como promissora no tratamento do glioblastoma. Adicionalmente, conciliar o momento da administração dos complexos com o ritmo circadiano das células do glioblastoma pode potenciar significativamente a internalização celular e a expressão do gene e proteína. Esta estratégia cronobiologicamente otimizada constitui uma perspetiva inovadora para o desenvolvimento de tratamentos mais precisos e eficazes contra o glioblastoma. Futuras investigações pré-clínicas deverão dar prioridade ao estudo da biodisponibilidade dos sistemas de entrega, ao seu direcionamento tumoral e à farmacocinética em momentos específicos do dia, em modelos 3D de células tumorais primárias e modelos in vivo. Além disso, será relevante estudar a expressão temporal de biomarcadores do glioblastoma e os efeitos do seu silenciamento na sobrevivência e terapia. Compreender de que forma a dinâmica da barreira hematoencefálica, nomeadamente a sua permeabilidade, oscila com o ritmo circadiano e afeta a internalização dos sistemas de entrega, trará melhorias significativas a esta estratégia. Em última análise, esta investigação fomenta a translação clínica destes complexos para uma terapia mais efetiva do glioblastoma.
O cancro é atualmente a segunda principal causa de morte a nível mundial, constituindo uma preocupação significativa de saúde pública. A Europa, a seguir à Ásia, é, segundo o Observatório Mundial do Cancro (GLOBOCAN), o segundo continente com maior incidência, mortalidade e prevalência de casos. As estatísticas indicam que o número de mortes relacionadas com cancro na Europa deverá aumentar 36.4 % até 2050, em comparação a 2022. Em particular, o glioblastoma (GB), designado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um astrocitoma de grau 4, representa o tipo mais prevalente (mais de 50 % dos casos) e agressivo de cancro cerebral primário em adultos. Este tipo de cancro caracteriza-se por uma elevada heterogeneidade, agressividade, angiogénese, invasividade, resistência às terapias atualmente implementadas e baixa taxa de sobrevivência (12-15 meses). A nível molecular, diversos mecanismos contribuem para a sua proliferação exacerbada, crescimento e resistência terapêutica, incluindo vias de sinalização alteradas (como a via supressora de tumor p53), mutações genéticas (nomeadamente no gene supressor de tumor TP53, recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), isocitrato desidrogenase (IDH)1/2, entre outros), e metilação do promotor do gene da O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT). Por estas razões, os tratamentos atualmente disponíveis, como o protocolo clássico de Stupp, enfrentam várias limitações. Este protocolo baseia-se, numa primeira fase, na remoção cirúrgica do tumor, preservando a função neurológica normal, seguida de radioterapia e quimioterapia com Temozolomida (TMZ), cuja eficácia depende do estado de metilação do promotor do gene da MGMT. No entanto, mesmo após este tratamento, o prognóstico dos doentes permanece bastante reservado, com 90 % a apresentar recidiva tumoral num período de dois anos. Assim, o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais eficazes torna-se essencial no combate a esta doença. Estratégias terapêuticas inovadoras, como a nanotecnologia, a terapia génica e a cronoterapia, têm vindo a ser desenvolvidas e exploradas para melhorar a eficácia dos tratamentos do glioblastoma. A terapia génica consiste na entrega de ácidos nucleicos às células com o objetivo de ativar, silenciar, modificar ou editar determinados genes, corrigindo defeitos genéticos que possam contribuir para a progressão de uma determinada doença. Neste contexto, corrigir a expressão génica alterada, uma vez que várias mutações foram associadas ao glioblastoma, poderá ser uma abordagem promissora. No entanto, a entrega eficaz de ácidos nucleicos às células é desafiante sem o uso de sistemas de entrega. A nanotecnologia, através da utilização de vetores não virais (como péptidos penetradores de células, lipossomas, polímeros, exossomas, dendrímeros, entre outros), permite uma entrega precisa de fármacos anticancerígenos e ácidos nucleicos a locais específicos, superando várias barreiras fisiológicas, como a barreira hematoencefálica. A utilização de ligandos à superfície dos sistemas de entrega, capazes de reconhecer recetores tumorais específicos, pode minimizar os efeitos secundários e melhorar a resposta terapêutica. Recentemente, o estudo do ritmo circadiano das células cancerígenas, frequentemente desregulado, demonstrou que o relógio circadiano desempenha um papel relevante no desenvolvimento do cancro e na eficácia terapêutica. O ritmo circadiano define-se como uma oscilação aproximada de 24 horas dos processos fisiológicos e metabólicos, sincronizada com o ciclo diurno da Terra. Diversos estudos indicam que estes ritmos podem modular a eficácia e os efeitos secundários dos fármacos, bem como a internalização celular e eficácia dos sistemas de entrega. Foi demonstrado que alguns fármacos anticancerígenos são mais bem tolerados e mais eficazes a determinadas alturas do dia. Neste contexto, o principal objetivo desta tese de doutoramento foi desenhar e desenvolver um sistema de entrega funcionalizado, com direcionamento às células do glioblastoma, e avaliar a influência do ritmo circadiano na eficácia do direcionamento, internalização, libertação do fármaco e ADN plasmídico (pADN) e, em última análise, no efeito terapêutico, promovendo uma estratégia de tratamento oncológico precisa. Esta abordagem centrou-se na utilização do péptido WRAP5, para construir um sistema de entrega contendo um ligando para o recetor de transferrina, com o objetivo de co- entregar o fármaco anticancerígeno TMZ e um plasmídeo de ADN codificante para o gene supressor de tumor p53 a células do glioblastoma. Este sistema foi projetado para apresentar uma capacidade melhorada de direcionamento e internalização em células cerebrais, bem como de penetração na barreira hematoencefálica. O primeiro passo consistiu na caracterização das suas propriedades físico-químicas (tamanho, índice de polidispersidade, carga superficial e capacidade de complexação), morfologia e biocompatibilidade. Os resultados revelaram que estas propriedades são dependentes do rácio entre os grupos amina do péptido e os grupos fosfato do ADN, N/P, que pode ser otimizado para melhorar as características desejadas para os complexos. As formulações demonstraram propriedades físico-químicas adequadas para aplicações in vitro, e a microscopia de fluorescência com células U87, confirmou a sua capacidade de internalização e de entrega do pADN ao núcleo das células. Após a colocalização no núcleo das células, observou-se a transcrição e tradução da p53. Os complexos reduziram ainda significativamente a viabilidade das células do glioblastoma. Num modelo tridimensional (3D) de esferóides U87 de 9 dias, gerado por dois protocolos diferentes, os complexos demonstraram ter efeito na morfologia e tamanho dos esferóides após uma única administração. Além disso, os complexos mostraram ser biocompatíveis com várias células não cancerígenas e com embriões de peixe-zebra (Danio rerio). Experiências com outras duas linhas celulares de glioblastoma (SNB19 e U373) também evidenciaram a capacidade dos complexos em serem internalizados e induzirem a expressão da p53. Nestas linhas celulares, a ativação da apoptose envolveu a via intrínseca. Esta tese teve ainda como objetivo elucidar a influência dos componentes centrais do relógio circadiano na performance dos complexos peptídicos desenvolvidos, nomeadamente, na expressão do recetor de transferrina, na internalização dos complexos e na promoção da expressão da p53. Os resultados obtidos demonstraram que, em momentos específicos, a atividade circadiana mais elevada do regulador circadiano PER2 e do recetor de transferrina levaram a uma maior internalização celular dos complexos, indução da expressão do TP53 e consequentemente da expressão da p53. Em suma, o conjunto abrangente de dados obtidos nesta tese fornece evidências sólidas sobre o elevado potencial terapêutico dos complexos TMZ/WRAP5/TP53 para uma transfeção celular direcionada, expressão da p53 e ativação de vias apoptóticas. Esta abordagem apresenta-se como promissora no tratamento do glioblastoma. Adicionalmente, conciliar o momento da administração dos complexos com o ritmo circadiano das células do glioblastoma pode potenciar significativamente a internalização celular e a expressão do gene e proteína. Esta estratégia cronobiologicamente otimizada constitui uma perspetiva inovadora para o desenvolvimento de tratamentos mais precisos e eficazes contra o glioblastoma. Futuras investigações pré-clínicas deverão dar prioridade ao estudo da biodisponibilidade dos sistemas de entrega, ao seu direcionamento tumoral e à farmacocinética em momentos específicos do dia, em modelos 3D de células tumorais primárias e modelos in vivo. Além disso, será relevante estudar a expressão temporal de biomarcadores do glioblastoma e os efeitos do seu silenciamento na sobrevivência e terapia. Compreender de que forma a dinâmica da barreira hematoencefálica, nomeadamente a sua permeabilidade, oscila com o ritmo circadiano e afeta a internalização dos sistemas de entrega, trará melhorias significativas a esta estratégia. Em última análise, esta investigação fomenta a translação clínica destes complexos para uma terapia mais efetiva do glioblastoma.
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Palavras-chave
Apoptose Cronoterapia Cultura Celular 3D Estado de Metilação da MGMT Estudos In Vitro Mutação no TP53 Nanotecnologia Péptidos Penetradores de Células Ritmo Circadiano Sistemas De Coentrega de TMZ/TP53 Terapia Direcionada Terapia do Glioblastoma Terapia Génica 3D Cell Culture Model Apoptosis Cell-Penetrating Peptides Chronotherapy Circadian Rhythm Gene Therapy Glioblastoma Therapy In Vitro Studies MGMT Methylation Status Nanotechnology Targeted Therapy TMZ/TP53 Co-Delivery Systems Tp53 Mutation