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Abstract(s)
Prostate cancer (PCa) is one of the most common cancers in the male population
and continues to be a considerable source of morbidity and mortality for men worldwide.
In an early stage of the disease, the cancer is confined to the prostate gland depending on
the stimulating action of androgens. This dependence is the characteristic that allows the
use of androgen-deprivation therapy (ADT), which is based on reducing circulating levels
of androgens or blocking their actions. The continuous administration of this therapy makes
the PCa cells resistant to treatment, being able to survive, extravasate the prostate gland
and cause metastases. This stage of the disease is the so-called castrate-resistant PCa
(CRPC) and involves the use of chemotherapeutic agents. The limitations of the existent
therapeutic options have been stimulating the use of combined therapies targeting survival
regulators and proteins involved in the regulation of prostate cell growth and its emergence
as a promising option for the treatment of PCa. The development and progression of PCa
results from several genetic and metabolic changes, which give tumor cells treatment
resistance, exacerbated proliferation capacity and invasive features. Interestingly, many
cancer-associated proteins have been reported to have a multifunctional role in controlling
the biological changes acquired by PCa cells. Among them is STEAP1 (“Six-Transmembrane
Epithelial Antigen of the Prostate”).
STEAP1 is a transmembrane protein identified as overexpressed in PCa and several
other types of cancer. In non-tumor tissues, STEAP1 expression is low and only restricted
to the prostate gland, suggesting that the increase in its expression may favor and
accompany tumor development. STEAP1 has been suggested to act as an oncogene, as this
protein appears to have the ability to regulate cell proliferation, apoptosis, invasion and
metastasis leading to PCa progression. Furthermore, several studies have shown that
STEAP1 is involved in intercellular communication and can function as an ion channel or
transporter protein. Thus, taking into account the various biological processes that may be
controlled by STEAP1, its location and overexpression at the cell surface, and its low
expression in non-tumor tissues, it is predictable that this protein plays a crucial role in the
maintenance of cell homeostasis and might be used as a possible therapeutic target for PCa.
However, the clinical significance of STEAP1 expression in PCa and its usefulness as a
biomarker still needs clarification. Furthermore, there are few studies on the regulation of
STEAP1 expression in PCa and on cellular mechanisms underlying biological functions in
PCa.
The present thesis aimed to first establish the clinical significance of the STEAP1
protein in PCa and explore its usefulness as a biomarker. Its relationship with the other proteins of the STEAP family (STEAP2, STEAP3 and STEAP4) was also investigated. Using
databases and bioinformatics tools, it was found that the STEAP1 gene is differentially
expressed in PCa, from benign lesions to metastatic adenocarcinoma, suggesting that
deregulation of this gene may be involved in the early stages of the development of the
disease. Concerning to the other STEAP family proteins, our results indicate that STEAP2
and STEAP4 are also overexpressed in PCa, but STEAP3 is underexpressed. However, only
the high expression of STEAP1 was associated with a poor prognosis of patients with PCa,
compared to patients without alterations in the expression of STEAP family proteins.
Furthermore, comparing only patients with alterations in the expression of these proteins,
we found that the overexpression of STEAP1 continues to be associated with a worse
prognosis, while the overexpression of STEAP4 indicates a good prognosis for patients with
PCa, meaning a longer survival time.
The dysregulation of STEAP1 can have a high impact on the development of PCa,
and the work developed in this thesis demonstrated that STEAP1 can be regulated by
epigenetic mechanisms. In addition to confirming the high expression of STEAP1 in
neoplastic prostate cell lines (LNCaP) and the low expression of this gene in non-neoplastic
prostate cell lines (PNT1A), it was found that the CpG island located at near the
transcription start site is methylated in PNT1A cells and demethylated in LNCaP cells. This
result suggested that demethylation of the STEAP1 gene promoter may contribute to its
overexpression in PCa. The recruitment of enzymes, such as DNA methyltransferases and
histone deacetylases, are essential for epigenetic modifications to occur. The treatment of
PNT1A cells with inhibitors of these enzymes increased the expression of the STEAP1 gene,
suggesting once again that the hypomethylation of the STEAP1 gene promoter may be
associated with its overexpression in PCa.
The global characterization of the proteome of LNCaP cells silenced for STEAP1 in
order to unravel new molecular and cellular functions associated with STEAP1 was another
focus of this dissertation. For this, LNCaP cells silenced, or not, for STEAP1 were subjected
to protein identification and quantification techniques. Comparing the two experimental
groups (STEAP1 siRNA LNCaP cells versus scramble siRNA-LNCaP cells), 526 proteins
were found to be differentially expressed. The cellular processes of endocytosis, RNA
transport, apoptosis, amino acid biosynthesis and metabolic pathways were the most
significant, suggesting that STEAP1 can modulate these biological processes. In fact,
STEAP1 silencing promotes apoptosis of PCa cells, attenuating cell proliferation and
metabolism, stimulates endocytosis and diminishes intercellular communication by
vesicles. These results emphasized the oncogenic role of STEAP1 in PCa.
Finally, it was found that the action of antiandrogenic drugs on LNCaP cells, namely
bicalutamide, enzalutamide and apalutamide, appears to be independent of STEAP1 expression levels. On the other hand, treatment of LNCaP cells with taxane-based
chemotherapeutic drugs, paclitaxel, docetaxel and cabazitaxel, appears to depend on
STEAP1 levels. High STEAP1 expression levels seem to promote a more efficient action of
chemotherapeutic drugs based on taxanes, with stimulation of apoptosis and a decrease in
uncontrolled proliferation of prostate cells.
In conclusion, the main results of this thesis confirmed the crucial action of STEAP1
in development and progression of PCa. This dissertation showed that STEAP1
overexpression may be used as a prognostic biomarker, indicating that patients with PCa
overexpressing this gene have a shorter survival time; also it showed that the reduction of
STEAP1 expression might be a therapeutic strategy to decrease the development and
progression of PCa; and yet, in an innovative way, this thesis demonstrated that the action
of chemotherapeutic drugs based on taxanes are more effective in the treatment of PCa
overexpressing STEAP1. Additional investigation into the relationship between STEAP1 and
PCa will be a fundamental basis for the development of new therapeutic approaches for PCa,
as well as its usefulness as biomarker.
O cancro da próstata (PCa, “prostate cancer”) é um dos cancros mais frequentes na população masculina e continua a ser uma considerável fonte de morbidade e mortalidade para os homens no mundo inteiro. Numa fase inicial da doença, o cancro está confinado à glândula prostática dependendo da ação estimuladora dos androgénios. Esta dependência é a característica que permite a utilização da terapêutica de privação androgénica (ADT, “androgen-deprivation therapy”), a qual tem por base a redução dos níveis circulantes de androgénios ou o bloqueio das suas ações. A continua administração desta terapia leva a que as células neoplásicas da próstata se tornem resistentes ao tratamento, sendo capazes de sobreviver, extravasar a glândula prostática e originar metástases. Esta fase da doença designa-se PCa resistente à castração (CRPC, “castrate-resistant PCa”) e implica o uso de agentes quimioterapêuticos. Pelas limitações que as terapêuticas existentes apresentam, o uso de terapias combinadas direcionadas aos reguladores de sobrevivência e às proteínas envolvidas na regulação do crescimento celular prostático tem surgido como uma opção promissora para o tratamento do PCa. O desenvolvimento e progressão do PCa resulta de diversas alterações genéticas e metabólicas, que conferem às células tumorais resistência ao tratamento, capacidade de proliferação exacerbada, e características invasivas. Curiosamente, muitas proteínas associadas ao cancro têm sido referidas como tendo um papel multifuncional no controlo das alterações biológicas que as células do PCa adquirem. Entre elas, está a STEAP1 (“Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate”). A STEAP1 é uma proteína transmembranar identificada como sobre-expressa no PCa e em vários outros tipos de cancros. Em tecidos não tumorais, a expressão da STEAP1 é baixa e apenas restrita à glândula prostática, o que sugere que o aumento da sua expressão poderá favorecer e acompanhar o desenvolvimento tumoral. Tem sido sugerida a função da STEAP1 como um oncogene, dada a sua capacidade de regular a proliferação celular, apoptose, invasão e metastização conduzindo à progressão do PCa. Para além disso, vários estudos têm demonstrado que a STEAP1 está envolvida na comunicação intercelular podendo funcionar como um canal iónico ou proteína transportadora. Assim, tendo em consideração os vários processos biológicos que podem estar associados ao papel da STEAP1, a sua localização e sobre-expressão à superfície da célula, e à sua reduzida expressão em tecido não tumorais, torna-se previsível que esta proteína exerça um papel crucial na manutenção da homeostase celular e possa ser usada como um possível alvo terapêutico para o PCa. No entanto, o significado clínico da expressão da STEAP1 no PCa e a sua utilidade como um biomarcador necessitam ainda de alguma clarificação. Para além disso, existem poucos estudos sobre a regulação da expressão da STEAP1 no PCa e sobre os mecanismos celulares subjacentes às funções biológicas no PCa. A presente tese teve como primeiro objetivo estabelecer o significado clínico da proteína STEAP1 no PCa e explorar a sua utilidade como um biomarcador. Também foi investigada a sua relação com as outras proteínas da família da STEAP (STEAP2, STEAP3 e STEAP4). Através de bases de dados e ferramentas bioinformáticas, verificou-se que o STEAP1 é um gene diferencialmente expresso no PCa, desde lesões benignas até adenocarcinoma metastático, sugerindo que desregulação deste gene pode estar envolvida nas fases iniciais do desenvolvimento da doença. Relativamente às outras proteínas da família da STEAP, os nossos resultados indicam que o STEAP2 e STEAP4 são também sobre-expressos no PCa, e que o STEAP3 é sub-expresso. No entanto, apenas a elevada expressão do STEAP1 foi associada a um mau prognóstico em pacientes com PCa, comparativamente a pacientes sem alterações na expressão das proteínas da família da STEAP. Para além disso, comparando apenas pacientes com alterações na expressão destas proteínas, verificamos que a sobre-expressão do STEAP1 continua a ser associada a pior prognóstico, enquanto que a sobre-expressão do STEAP4 indica um bom prognóstico para pacientes com PCa estando associado a um maior tempo de sobrevida. A desregulação da STEAP1 pode exercer alto impacto no desenvolvimento do PCa, e no trabalho desenvolvido nesta tese demostramos que o STEAP1 pode ser regulado por mecanismos epigenéticos. Para além de se confirmar a alta expressão do STEAP1 em linhas celulares neoplásicas da próstata (LNCaP) e a baixa expressão deste gene em linhas celular não neoplásicas da próstata (PNT1A), verificou-se que a ilha CpG localizada junto do local de início da transcrição está metilada em células PNT1A e desmetilada em células LNCaP. Este resultado sugeriu que a desmetilação do promotor do gene STEAP1 poderá contribuir para a sua sobre-expressão no PCa. O recrutamento de enzimas como as DNA metiltransferases e histonas desacetilases são essenciais para que ocorram estas alterações epigenéticas. O tratamento das células PNT1A com inibidores destas enzimas aumentou a expressão do gene STEAP1, sugerindo mais uma vez, que a hipometilação do promotor do gene STEAP1 poderá estar associado à sobre-expressão no PCa. A caracterização global do proteoma de células LNCaP silenciadas para o STEAP1 de forma a aprofundar as funções moleculares e celulares da proteína STEAP1 foi outro dos focos desta dissertação. Para isso, células LNCaP silenciadas, ou não silenciadas para o STEAP1 foram sujeitas a técnicas de identificação e quantificação proteica. Comparando os dois grupos experimentais (células LNCaP silenciadas versus células LNCaP não silenciadas), foram encontradas 526 proteínas diferencialmente expressas. Os processos celulares de endocitose, transporte de RNA, apoptose, biossíntese de aminoácidos e vias metabólicas foram os mais significativos, sugerindo que a STEAP1 pode modelar estes processos biológicos. De facto, o silenciamento do gene STEAP1 promove a apoptose das células do PCa atenuando a proliferação e o metabolismo celular, estimula a endocitose e enfraquece a comunicação intercelular através de vesiculas. Estes resultados reforçam o papel oncogénico da STEAP1 no PCa. Por último, verificou-se em células LNCaP, que a ação de fármacos antiandrogénicos, nomeadamente bicalutamida, enzalutamida e apalutamida parece ser independente dos níveis de expressão da STEAP1. Por outro lado, o tratamento de células LNCaP com fármacos quimiterapêuticos à base de taxanos, paclitaxel, docetaxel e cabazitaxel, parece depender dos níveis de STEAP1. A aumentada expressão da STEAP1 parece promover uma ação mais eficiente dos fármacos quimiterapêuticos à base de taxanos, verificando-se estimulação da apoptose e diminuição da proliferação descontrolada das células da próstata. Em conclusão, os principais resultados desta tese confirmaram assim a ação crucial da STEAP1 no desenvolvimento e progressão do PCa. Esta dissertação demonstrou que a sobre-expressão do STEAP1 poderá ser usada como um biomarcador de prognóstico, indicando que pacientes com PCa sobre-expressando este gene têm um menor tempo de sobrevida; também mostrou que a redução da expressão da STEAP1 poderá ser uma estratégia terapêutica para diminuir o desenvolvimento e progressão do PCa; e ainda, de forma inovadora, esta tese demonstrou que a ação de fármacos quimioterapêuticos à base de taxanos são mais eficazes no tratamento do PCa sobre-expressando STEAP1. Investigação adicional sobre a relação da STEAP1 no PCa poderá vir a ser uma base fundamental para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o PCa, assim como para a sua utilização como biomarcador.
O cancro da próstata (PCa, “prostate cancer”) é um dos cancros mais frequentes na população masculina e continua a ser uma considerável fonte de morbidade e mortalidade para os homens no mundo inteiro. Numa fase inicial da doença, o cancro está confinado à glândula prostática dependendo da ação estimuladora dos androgénios. Esta dependência é a característica que permite a utilização da terapêutica de privação androgénica (ADT, “androgen-deprivation therapy”), a qual tem por base a redução dos níveis circulantes de androgénios ou o bloqueio das suas ações. A continua administração desta terapia leva a que as células neoplásicas da próstata se tornem resistentes ao tratamento, sendo capazes de sobreviver, extravasar a glândula prostática e originar metástases. Esta fase da doença designa-se PCa resistente à castração (CRPC, “castrate-resistant PCa”) e implica o uso de agentes quimioterapêuticos. Pelas limitações que as terapêuticas existentes apresentam, o uso de terapias combinadas direcionadas aos reguladores de sobrevivência e às proteínas envolvidas na regulação do crescimento celular prostático tem surgido como uma opção promissora para o tratamento do PCa. O desenvolvimento e progressão do PCa resulta de diversas alterações genéticas e metabólicas, que conferem às células tumorais resistência ao tratamento, capacidade de proliferação exacerbada, e características invasivas. Curiosamente, muitas proteínas associadas ao cancro têm sido referidas como tendo um papel multifuncional no controlo das alterações biológicas que as células do PCa adquirem. Entre elas, está a STEAP1 (“Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate”). A STEAP1 é uma proteína transmembranar identificada como sobre-expressa no PCa e em vários outros tipos de cancros. Em tecidos não tumorais, a expressão da STEAP1 é baixa e apenas restrita à glândula prostática, o que sugere que o aumento da sua expressão poderá favorecer e acompanhar o desenvolvimento tumoral. Tem sido sugerida a função da STEAP1 como um oncogene, dada a sua capacidade de regular a proliferação celular, apoptose, invasão e metastização conduzindo à progressão do PCa. Para além disso, vários estudos têm demonstrado que a STEAP1 está envolvida na comunicação intercelular podendo funcionar como um canal iónico ou proteína transportadora. Assim, tendo em consideração os vários processos biológicos que podem estar associados ao papel da STEAP1, a sua localização e sobre-expressão à superfície da célula, e à sua reduzida expressão em tecido não tumorais, torna-se previsível que esta proteína exerça um papel crucial na manutenção da homeostase celular e possa ser usada como um possível alvo terapêutico para o PCa. No entanto, o significado clínico da expressão da STEAP1 no PCa e a sua utilidade como um biomarcador necessitam ainda de alguma clarificação. Para além disso, existem poucos estudos sobre a regulação da expressão da STEAP1 no PCa e sobre os mecanismos celulares subjacentes às funções biológicas no PCa. A presente tese teve como primeiro objetivo estabelecer o significado clínico da proteína STEAP1 no PCa e explorar a sua utilidade como um biomarcador. Também foi investigada a sua relação com as outras proteínas da família da STEAP (STEAP2, STEAP3 e STEAP4). Através de bases de dados e ferramentas bioinformáticas, verificou-se que o STEAP1 é um gene diferencialmente expresso no PCa, desde lesões benignas até adenocarcinoma metastático, sugerindo que desregulação deste gene pode estar envolvida nas fases iniciais do desenvolvimento da doença. Relativamente às outras proteínas da família da STEAP, os nossos resultados indicam que o STEAP2 e STEAP4 são também sobre-expressos no PCa, e que o STEAP3 é sub-expresso. No entanto, apenas a elevada expressão do STEAP1 foi associada a um mau prognóstico em pacientes com PCa, comparativamente a pacientes sem alterações na expressão das proteínas da família da STEAP. Para além disso, comparando apenas pacientes com alterações na expressão destas proteínas, verificamos que a sobre-expressão do STEAP1 continua a ser associada a pior prognóstico, enquanto que a sobre-expressão do STEAP4 indica um bom prognóstico para pacientes com PCa estando associado a um maior tempo de sobrevida. A desregulação da STEAP1 pode exercer alto impacto no desenvolvimento do PCa, e no trabalho desenvolvido nesta tese demostramos que o STEAP1 pode ser regulado por mecanismos epigenéticos. Para além de se confirmar a alta expressão do STEAP1 em linhas celulares neoplásicas da próstata (LNCaP) e a baixa expressão deste gene em linhas celular não neoplásicas da próstata (PNT1A), verificou-se que a ilha CpG localizada junto do local de início da transcrição está metilada em células PNT1A e desmetilada em células LNCaP. Este resultado sugeriu que a desmetilação do promotor do gene STEAP1 poderá contribuir para a sua sobre-expressão no PCa. O recrutamento de enzimas como as DNA metiltransferases e histonas desacetilases são essenciais para que ocorram estas alterações epigenéticas. O tratamento das células PNT1A com inibidores destas enzimas aumentou a expressão do gene STEAP1, sugerindo mais uma vez, que a hipometilação do promotor do gene STEAP1 poderá estar associado à sobre-expressão no PCa. A caracterização global do proteoma de células LNCaP silenciadas para o STEAP1 de forma a aprofundar as funções moleculares e celulares da proteína STEAP1 foi outro dos focos desta dissertação. Para isso, células LNCaP silenciadas, ou não silenciadas para o STEAP1 foram sujeitas a técnicas de identificação e quantificação proteica. Comparando os dois grupos experimentais (células LNCaP silenciadas versus células LNCaP não silenciadas), foram encontradas 526 proteínas diferencialmente expressas. Os processos celulares de endocitose, transporte de RNA, apoptose, biossíntese de aminoácidos e vias metabólicas foram os mais significativos, sugerindo que a STEAP1 pode modelar estes processos biológicos. De facto, o silenciamento do gene STEAP1 promove a apoptose das células do PCa atenuando a proliferação e o metabolismo celular, estimula a endocitose e enfraquece a comunicação intercelular através de vesiculas. Estes resultados reforçam o papel oncogénico da STEAP1 no PCa. Por último, verificou-se em células LNCaP, que a ação de fármacos antiandrogénicos, nomeadamente bicalutamida, enzalutamida e apalutamida parece ser independente dos níveis de expressão da STEAP1. Por outro lado, o tratamento de células LNCaP com fármacos quimiterapêuticos à base de taxanos, paclitaxel, docetaxel e cabazitaxel, parece depender dos níveis de STEAP1. A aumentada expressão da STEAP1 parece promover uma ação mais eficiente dos fármacos quimiterapêuticos à base de taxanos, verificando-se estimulação da apoptose e diminuição da proliferação descontrolada das células da próstata. Em conclusão, os principais resultados desta tese confirmaram assim a ação crucial da STEAP1 no desenvolvimento e progressão do PCa. Esta dissertação demonstrou que a sobre-expressão do STEAP1 poderá ser usada como um biomarcador de prognóstico, indicando que pacientes com PCa sobre-expressando este gene têm um menor tempo de sobrevida; também mostrou que a redução da expressão da STEAP1 poderá ser uma estratégia terapêutica para diminuir o desenvolvimento e progressão do PCa; e ainda, de forma inovadora, esta tese demonstrou que a ação de fármacos quimioterapêuticos à base de taxanos são mais eficazes no tratamento do PCa sobre-expressando STEAP1. Investigação adicional sobre a relação da STEAP1 no PCa poderá vir a ser uma base fundamental para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o PCa, assim como para a sua utilização como biomarcador.
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Keywords
STEAP1 - Proteína transmembranar Cancro da próstata Prognóstico Alterações epigenéticas Proteómica Fármacos anti-andrógenos Quimioterapêuticos