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Authors
Abstract(s)
Human papillomavirus (HPV) is the main causative agent for the development of
cervical cancer, the fourth most common cancer in women worldwide. Overexpression
of HPV oncoproteins E6 and E7 are present on this type of cancer, disrupting the cell
cycle regulation and proliferation through the involvement of tumor suppressor
proteins p53 and pRb, respectively.
Although preventive anti-HPV vaccines already exist, therapies for this type of cancer
are still under development in order to find an effective cure for this type of cancer.
Flavonoids have shown a high potential in such therapy, offering an effective and lowcost method that enables their use in less developed countries and where health care is
poorer.
Quercetin is the main flavonoid in therapeutic uses presenting high anticancer
properties, showing particular prominence in cervical cancer therapy due to the fact
that it potentiates E6 oncoprotein inhibition, thereby increasing p53 expression and
thereby inducing apoptosis. However, quercetin use is limited due to its insolubility in
aqueous medium and its low stability. Thus, quercetin low bioavailability limits its
application in cancer therapies.
Thus, this master thesis aims to develop quercetin-loaded delivery systems to enhance
its bioavailability and effect in HPV positive cells.
Three types of systems were formulated and characterized, one composed of sulfobutyl
ether ß-Cyclodextrin (SBE-ß-CD) and the other two were chitosan-based, one
conjugated with tripolyphosphate (TPP) and other with SBE-ß-CD. SBE-ßCD/Quercetin delivery systems had a size of 2468.33 nm, a polydispersity Index (PdI)
of 0.123, a zeta potential of -21.03 mV and an encapsulation efficiency of approximately
100%. The Chitosan/TPP/Quercetin delivery systems showed a size of 325.1 nm, a PdI
of 0.371, a zeta potential of +16.6 mV and an encapsulation efficiency of 10.80%.
Finally, Chitosan/SBE-ß-CD/Quercetin delivery systems presented a size of 272.07 nm,
a PdI of 0.287, a zeta potential of +38.0 mV and an encapsulation rate of approximately
100%. Scanning electron microscopy (SEM) was performed for all delivery systems, being
possible to verify that Chitosan/TPP/Quercetin and Chitosan/SBE-ß-CD/Quercetin
systems presented a regular and spherical morphology. Furthermore, fourier transform
infrared spectroscopy (FTIR) and UV/vis spectra were also obtained and it was possible
to verify the presence of all compounds and the interactions between them, and, for the
systems composed by SBE-ß-CD it was also possible to verify that it was completely
trapped inside the inclusion complexes.
Cell viability assays were performed in HeLa cells (HPV positive) for each type of
formulated system, with the most promising results being seen for the Chitosan/SBE-ßCD/Quercetin delivery systems. This type of delivery system showed a reduction in half
inhibitory concentration (IC50) from 59.84 µM to 43.55 µM for 48 h of incubation when
compared with free quercetin.
In this manner, the results indicated that there is an increased therapeutic effect after
encapsulation with Chitosan/SBE-ß-CD/Quercetin systems, thus representing a step
forward in the design/development of flavonoids-based delivery systems for cervical
cancer therapy applications.
O cancro é uma das principais causas de morte a nível mundial, originando mais de 19,3 milhões de casos em 2020, resultando em aproximadamente 10 milhões de mortes. Vários fatores de risco já foram atribuídos ao aparecimento do cancro, sendo a idade, a predisposição genética, a etnia, a exposição ambiental, os estilos de vida e infeções causadas por bactérias, parasitas ou vírus os mais preponderantes. O vírus do papiloma humano (HPV) é o principal agente causador do desenvolvimento do cancro do colo do útero, o quarto cancro mais comum nas mulheres em todo o mundo e responsável por mais de 340.000 mortes em 2020. A excessiva expressão das oncoproteínas HPV E6 e E7 estão presentes neste tipo de cancro, alterando a regulação do ciclo celular e a sua proliferação mediante o comprometimento das proteínas supressoras de tumor p53 e pRb, respetivamente. Apesar de já se encontrarem disponíveis vacinas preventivas anti-HPV, a sua administração não é amplamente realizada a toda a população. Desta forma, estão ainda em processo de desenvolvimento terapias para este tipo de cancro, a fim de se conseguir uma cura eficaz. Neste sentido, os flavonoides demonstraram um elevado potencial terapêutico, oferecendo um método eficaz e de baixo custo que permite a sua utilização em países menos desenvolvidos e onde os cuidados de saúde são mais limitados. A quercetina é o principal flavonoide em usos terapêuticos apresentando inúmeras propriedades anticancerígenas e mostrando particular relevância na terapia do cancro do colo do útero devido ao facto de potenciar a inibição da ação da oncoproteína E6, aumentando assim a expressão da p53 e induzindo assim a apoptose. Contudo, o uso da quercetina é limitado devido à sua insolubilidade em meio aquoso e à sua baixa estabilidade. Assim, a baixa biodisponibilidade da quercetina limita as suas aplicações em terapias do cancro. Desta forma, esta dissertação de mestrado visa desenvolver sistemas de entrega para a encapsulação da quercetina no sentido de melhorar a sua biodisponibilidade e efeito em células HPV positivas. Foram formulados e caracterizados três tipos de sistemas, um constituído de éter sulfobutílico ß-Ciclodextrina (SBE-ß-CD) e os outros dois baseados em quitosano, um conjugado com tripolifosfato de sódio (TPP) e outro com SBE-ß-CD. Os sistemas de entrega de SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram um tamanho de 2468,33 nm, um índice de polidispersidade (PdI) de 0,123, um potencial zeta de -21,03 mV e uma eficiência de encapsulamento de aproximadamente 100%. Os sistemas de entrega Quitosano/TPP/Quercetina mostraram um tamanho de 325,1 nm, um PdI de 0,371, um potencial zeta de +16,6 mV e uma eficiência de encapsulamento de 10,80%. Finalmente, os sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram uma dimensão de 272,07 nm, um PdI de 0,287, um potencial zeta de +38,0 mV e uma taxa de encapsulamento de aproximadamente 100%. Foi realizada microscopia eletrónica de varrimento (SEM) para todos os sistemas de entrega, sendo possível verificar que os sistemas de Quitosano/TPP/Quercetina e Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram uma morfologia regular e esférica. Já para o caso dos sistemas de entrega de SBE-ß-CD/Quercetina foi possível verificar que a morfologia era irregular e não esférica. Além disso, foram também realizadas espectroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de UV/vis onde foi possível verificar a presença de todos os compostos e as interações entre eles. Para os sistemas compostos por SBE-ß-CD foi também possível verificar que a quercetina se encontrava completamente aprisionada dentro dos complexos de inclusão, não sendo visível os picos característicos da mesma nos espetros FTIR. Para os melhores rácios de cada tipo de sistema foram realizados ensaios de viabilidade celular em células HeLa (HPV positivas), onde os resultados mais promissores foram observados para os sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina. Este tipo de sistema de entrega mostrou uma redução na concentração média inibitória (IC50) de 59,84 µM para 43,55 µM durante 48h de incubação, quando comparado com a quercetina livre. Desta forma, os resultados indicaram que existe um aumento do efeito terapêutico após o encapsulamento da quercetina com sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ßCD/Quercetina, representando assim um passo em frente na conceção/desenvolvimento de sistemas de entrega baseados em flavonoides para aplicações de terapia do cancro do colo do útero.
O cancro é uma das principais causas de morte a nível mundial, originando mais de 19,3 milhões de casos em 2020, resultando em aproximadamente 10 milhões de mortes. Vários fatores de risco já foram atribuídos ao aparecimento do cancro, sendo a idade, a predisposição genética, a etnia, a exposição ambiental, os estilos de vida e infeções causadas por bactérias, parasitas ou vírus os mais preponderantes. O vírus do papiloma humano (HPV) é o principal agente causador do desenvolvimento do cancro do colo do útero, o quarto cancro mais comum nas mulheres em todo o mundo e responsável por mais de 340.000 mortes em 2020. A excessiva expressão das oncoproteínas HPV E6 e E7 estão presentes neste tipo de cancro, alterando a regulação do ciclo celular e a sua proliferação mediante o comprometimento das proteínas supressoras de tumor p53 e pRb, respetivamente. Apesar de já se encontrarem disponíveis vacinas preventivas anti-HPV, a sua administração não é amplamente realizada a toda a população. Desta forma, estão ainda em processo de desenvolvimento terapias para este tipo de cancro, a fim de se conseguir uma cura eficaz. Neste sentido, os flavonoides demonstraram um elevado potencial terapêutico, oferecendo um método eficaz e de baixo custo que permite a sua utilização em países menos desenvolvidos e onde os cuidados de saúde são mais limitados. A quercetina é o principal flavonoide em usos terapêuticos apresentando inúmeras propriedades anticancerígenas e mostrando particular relevância na terapia do cancro do colo do útero devido ao facto de potenciar a inibição da ação da oncoproteína E6, aumentando assim a expressão da p53 e induzindo assim a apoptose. Contudo, o uso da quercetina é limitado devido à sua insolubilidade em meio aquoso e à sua baixa estabilidade. Assim, a baixa biodisponibilidade da quercetina limita as suas aplicações em terapias do cancro. Desta forma, esta dissertação de mestrado visa desenvolver sistemas de entrega para a encapsulação da quercetina no sentido de melhorar a sua biodisponibilidade e efeito em células HPV positivas. Foram formulados e caracterizados três tipos de sistemas, um constituído de éter sulfobutílico ß-Ciclodextrina (SBE-ß-CD) e os outros dois baseados em quitosano, um conjugado com tripolifosfato de sódio (TPP) e outro com SBE-ß-CD. Os sistemas de entrega de SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram um tamanho de 2468,33 nm, um índice de polidispersidade (PdI) de 0,123, um potencial zeta de -21,03 mV e uma eficiência de encapsulamento de aproximadamente 100%. Os sistemas de entrega Quitosano/TPP/Quercetina mostraram um tamanho de 325,1 nm, um PdI de 0,371, um potencial zeta de +16,6 mV e uma eficiência de encapsulamento de 10,80%. Finalmente, os sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram uma dimensão de 272,07 nm, um PdI de 0,287, um potencial zeta de +38,0 mV e uma taxa de encapsulamento de aproximadamente 100%. Foi realizada microscopia eletrónica de varrimento (SEM) para todos os sistemas de entrega, sendo possível verificar que os sistemas de Quitosano/TPP/Quercetina e Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina apresentaram uma morfologia regular e esférica. Já para o caso dos sistemas de entrega de SBE-ß-CD/Quercetina foi possível verificar que a morfologia era irregular e não esférica. Além disso, foram também realizadas espectroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de UV/vis onde foi possível verificar a presença de todos os compostos e as interações entre eles. Para os sistemas compostos por SBE-ß-CD foi também possível verificar que a quercetina se encontrava completamente aprisionada dentro dos complexos de inclusão, não sendo visível os picos característicos da mesma nos espetros FTIR. Para os melhores rácios de cada tipo de sistema foram realizados ensaios de viabilidade celular em células HeLa (HPV positivas), onde os resultados mais promissores foram observados para os sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ß-CD/Quercetina. Este tipo de sistema de entrega mostrou uma redução na concentração média inibitória (IC50) de 59,84 µM para 43,55 µM durante 48h de incubação, quando comparado com a quercetina livre. Desta forma, os resultados indicaram que existe um aumento do efeito terapêutico após o encapsulamento da quercetina com sistemas de entrega de Quitosano/SBE-ßCD/Quercetina, representando assim um passo em frente na conceção/desenvolvimento de sistemas de entrega baseados em flavonoides para aplicações de terapia do cancro do colo do útero.
Description
Keywords
Cancro do Colo do Útero Flavonoides Hpv Quercetina Sistemas de Entrega