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Authors
Abstract(s)
Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) is the enzyme that O-methylates
catecholamine neurotransmitters, such as dopamine, epinephrine and norepinephrine, catechol
estrogens and other drugs and substances that have a catecholic structure. Due to its correlation
with Parkinson’s disease, cardiovascular diseases, and hormone-dependent cancers, COMT is of
great therapeutic interest. Parkinson's disease is a neurological disorder characterized by the
degradation of dopaminergic neurons, with a consequent reduction in dopamine levels in the
striatum. The most effective treatment for Parkinson’s disease to date involves the administration
of levodopa along with COMT and aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) inhibitors to
increase the amount of levodopa in the brain, since only 1% of the amount of levodopa
administered would reach the brain as it is degraded both by AADC, forming dopamine, and by
COMT, whose degradation would lead to the formation of 3-O-methyldopa. However,
commercially available COMT inhibitors lack effectiveness, have harmful effects and/or are
unable to cross the blood-brain barrier. Thus, it is crucial to find and develop new compounds
that are more powerful, less harmful and have better pharmacokinetics properties than the
inhibitors currently in clinical use. With this goal in mind, previously, our research group
synthesized a class of compounds known as triazolopyrimidines, which can be considered
catechol bioisosters and can thus interact with the active site of COMT. In the present work,
alizarin, a proven molecule capable of inhibiting COMT, was used as the basis for the synthesis of
a novel anthraquinone family compound. The synthesized compound, 3-nitroalizarin, shares
many structural similarities with tolcapone. There was also an attempt to synthesize histazarin,
an alizarin analogue, as well as the possibility of synthesizing 1-nitrohistazarin. Because of the
positions of the hydroxyl and nitro groups, these molecules are more similar to tolcapone than
alizarin and histazarin. Unfortunately, histazarin could not be synthesized, which prevented the
synthesis of 1-nitrohistazarine. The triazolopyrimidine derivatives and the anthraquinone
derivatives were subjected to molecular docking to determine which molecular interactions might
occur between the compounds and the active site of the protein and to access their binding
affinities. All compounds can be possible inhibitors since it was predicted that they would form
molecular interactions with the protein’s active site similar to those that tolcapone established,
exhibiting even higher binding energies than tolcapone. Recombinant human MBCOMT lysates
were used to test the potency of these compounds, being incubated with the compounds at several
concentrations to determine the IC50 values. All compounds had the capability to reduce the
MBCOMT activity, however triazolopyrimidine derivatives exhibited lower and constant
inhibition across the tested concentrations. Anthraquinone derivatives exhibited the highest
potency, with 3-nitroalizarin being the most potent. Subsequently, two different cell lines were
used, Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF) and Rat Dopaminergic Neural Cell Line (N27),
in cytotoxicity assays for the most promising compounds. These cells were treated with the compounds first in a screening trial and then in a concentration-response assay. While
compounds at 10 µM exhibit low cytotoxicity, cell viability dramatically decreases at 100 µM. The
results of the concentration-response assays show that the IC50 values are significantly higher
than those from the enzymatic assays, proving that these compounds are not hazardous at the
concentrations at which they inhibit 50% of COMT activity. Thus, it is concluded that alizarin and
3-nitroalizarin are both very promising molecules and should be used in further research on
hepatocyte toxicity testing, co-crystallization, and differential scanning fluorimetry, among
others.
A catecol-O-metiltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) é a enzima responsável pela degradação de catecolaminas neurotransmissoras (dopamina, adrenalina e noradrenalina), estrogénios catecólicos e inúmeras moléculas com estrutura catecólica. A COMT apresenta elevado interesse clínico, devido a estar associada a inúmeras doenças, nomeadamente à doença de Parkinson, doenças cardiovasculares e cancros hormono-dependentes, entre outras. A doença de Parkinson é uma desordem neurológica caracterizada pela degradação de neurónios dopaminérgicos, com consequente redução dos níveis de dopamina no espaço nigro-estriatal. Atualmente, a terapia mais eficaz é a administração de levodopa em conjugação com inibidores da COMT e da Laminoácido aromático descarboxilase (AADC), enzimas envolvidas no seu metabolismo, na esperança de se conseguir aumentar os níveis de levodopa que chegam ao cérebro para posterior conversão a dopamina. No entanto, os inibidores da COMT existentes comercialmente têm potência inferior à desejada, apresentam variadíssimos efeitos secundários e a maioria dos inibidores é incapaz de penetrar a barreira hematoencefálica. Assim, é vital a procura e desenvolvimento de novos compostos mais potentes, menos tóxicos e com melhores propriedades farmacocinéticas que os inibidores existentes. Com este objetivo em mente, anteriormente, o nosso grupo de investigação sintetizou um conjunto de triazolopirimidinas que podem ser consideradas bioisósteros de catecóis e que, por isso, poderiam interagir com o sítio ativo da COMT. No presente trabalho, além de se ter continuado a estudar o potencial interesse das triazolopirimidinas na inibição da COMT, foi também sintetizado um composto da família das antraquinonas, a partir de um já existente e já comprovado como inibidor da COMT, a alizarina. O composto sintetizado, a 3-nitroalizarina, tem uma estrutura bastante semelhante à do tolcapone, o composto comercial com maior poder inibitório da isoforma membranar da COMT (MBCOMT), podendo considerar-se um potencial inibidor da COMT. Adicionalmente, tentou-se também sintetizar um análogo da alizarina, histazarina, para posterior síntese da 1- nitrohistazarina. Estes compostos apresentam ainda maior semelhança com o tolcapone do que a alizarina e a 3-nitroalizarina, devido às posições dos grupos hidroxilo e nitro. No entanto, não foi possível sintetizar a histazarina, o que, por consequência, impossibilitou a síntese da 1- nitrohistazarina. O docking molecular foi utilizado como uma importante ferramenta para prever de que forma os compostos em estudo iriam interagir com o sítio ativo da proteína. Assim, tanto as triazolopirimidinas como as antraquinonas foram sujeitas ao docking molecular usando a estrutura tridimensional da MBCOMT obtida a partir do AlphaFold Protein Structure Database. Todos os compostos poderão formar interações moleculares com o sítio ativo da proteína semelhantes às interações estabelecidas pelo tolcapone, o que os torna potenciais inibidores da COMT. A potência destes compostos foi testada em lisados recombinantes da MBCOMT humana provenientes de Komagataella pastoris, tendo sido estudados em diferentes concentrações, concretamente, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 60 e 100 µM. Todos os compostos foram capazes de reduzir a atividade da MBCOMT, no entanto, os derivados de dihidrotriazolopirimidinas (DHPM) possuem uma inibição baixa e independente das diferentes concentrações testadas. Quanto aos derivados antraquinonas, estes foram os que apresentaram maior potência inibitória, sendo a 3- nitroalizarina a mais potente. Após os ensaios enzimáticos, os compostos mais promissores foram sujeitos a ensaios de citotoxicidade. Para isso, foram usadas duas linhas celulares distintas, fibroblastos normais da derme humana e uma linha neuronal dopaminérgica de rato, as quais foram incubadas com os compostos, primeiramente num ensaio de screening (10 e 100 µM) e posteriormente num ensaio para obtenção de curvas de concentração-resposta. Os compostos a 10 µM apresentaram baixa citotoxicidade enquanto a 100 µM observou-se um declínio drástico na viabilidade celular. Quanto aos ensaios concentração-resposta, os valores de concentração inibitória média (IC50) obtidos são consideravelmente superiores aos obtidos nos ensaios enzimáticos, o que indica que estes compostos não apresentam toxicidade nas concentrações a que inibem 50% da atividade da COMT. Conclui-se então que, tanto a alizarina como a 3- nitroalizarina, são compostos bastante promissores e que devem prosseguir para futuros estudos, tais como fluorimetria de varrimento diferencial, co-cristalização, ensaios de toxicidade em hepatócitos, entre outros.
A catecol-O-metiltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) é a enzima responsável pela degradação de catecolaminas neurotransmissoras (dopamina, adrenalina e noradrenalina), estrogénios catecólicos e inúmeras moléculas com estrutura catecólica. A COMT apresenta elevado interesse clínico, devido a estar associada a inúmeras doenças, nomeadamente à doença de Parkinson, doenças cardiovasculares e cancros hormono-dependentes, entre outras. A doença de Parkinson é uma desordem neurológica caracterizada pela degradação de neurónios dopaminérgicos, com consequente redução dos níveis de dopamina no espaço nigro-estriatal. Atualmente, a terapia mais eficaz é a administração de levodopa em conjugação com inibidores da COMT e da Laminoácido aromático descarboxilase (AADC), enzimas envolvidas no seu metabolismo, na esperança de se conseguir aumentar os níveis de levodopa que chegam ao cérebro para posterior conversão a dopamina. No entanto, os inibidores da COMT existentes comercialmente têm potência inferior à desejada, apresentam variadíssimos efeitos secundários e a maioria dos inibidores é incapaz de penetrar a barreira hematoencefálica. Assim, é vital a procura e desenvolvimento de novos compostos mais potentes, menos tóxicos e com melhores propriedades farmacocinéticas que os inibidores existentes. Com este objetivo em mente, anteriormente, o nosso grupo de investigação sintetizou um conjunto de triazolopirimidinas que podem ser consideradas bioisósteros de catecóis e que, por isso, poderiam interagir com o sítio ativo da COMT. No presente trabalho, além de se ter continuado a estudar o potencial interesse das triazolopirimidinas na inibição da COMT, foi também sintetizado um composto da família das antraquinonas, a partir de um já existente e já comprovado como inibidor da COMT, a alizarina. O composto sintetizado, a 3-nitroalizarina, tem uma estrutura bastante semelhante à do tolcapone, o composto comercial com maior poder inibitório da isoforma membranar da COMT (MBCOMT), podendo considerar-se um potencial inibidor da COMT. Adicionalmente, tentou-se também sintetizar um análogo da alizarina, histazarina, para posterior síntese da 1- nitrohistazarina. Estes compostos apresentam ainda maior semelhança com o tolcapone do que a alizarina e a 3-nitroalizarina, devido às posições dos grupos hidroxilo e nitro. No entanto, não foi possível sintetizar a histazarina, o que, por consequência, impossibilitou a síntese da 1- nitrohistazarina. O docking molecular foi utilizado como uma importante ferramenta para prever de que forma os compostos em estudo iriam interagir com o sítio ativo da proteína. Assim, tanto as triazolopirimidinas como as antraquinonas foram sujeitas ao docking molecular usando a estrutura tridimensional da MBCOMT obtida a partir do AlphaFold Protein Structure Database. Todos os compostos poderão formar interações moleculares com o sítio ativo da proteína semelhantes às interações estabelecidas pelo tolcapone, o que os torna potenciais inibidores da COMT. A potência destes compostos foi testada em lisados recombinantes da MBCOMT humana provenientes de Komagataella pastoris, tendo sido estudados em diferentes concentrações, concretamente, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 30, 60 e 100 µM. Todos os compostos foram capazes de reduzir a atividade da MBCOMT, no entanto, os derivados de dihidrotriazolopirimidinas (DHPM) possuem uma inibição baixa e independente das diferentes concentrações testadas. Quanto aos derivados antraquinonas, estes foram os que apresentaram maior potência inibitória, sendo a 3- nitroalizarina a mais potente. Após os ensaios enzimáticos, os compostos mais promissores foram sujeitos a ensaios de citotoxicidade. Para isso, foram usadas duas linhas celulares distintas, fibroblastos normais da derme humana e uma linha neuronal dopaminérgica de rato, as quais foram incubadas com os compostos, primeiramente num ensaio de screening (10 e 100 µM) e posteriormente num ensaio para obtenção de curvas de concentração-resposta. Os compostos a 10 µM apresentaram baixa citotoxicidade enquanto a 100 µM observou-se um declínio drástico na viabilidade celular. Quanto aos ensaios concentração-resposta, os valores de concentração inibitória média (IC50) obtidos são consideravelmente superiores aos obtidos nos ensaios enzimáticos, o que indica que estes compostos não apresentam toxicidade nas concentrações a que inibem 50% da atividade da COMT. Conclui-se então que, tanto a alizarina como a 3- nitroalizarina, são compostos bastante promissores e que devem prosseguir para futuros estudos, tais como fluorimetria de varrimento diferencial, co-cristalização, ensaios de toxicidade em hepatócitos, entre outros.
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Keywords
Catecol-o-Metiltransferase Derivados de Antraquinonas Doença de Parkinson Inibidores da Comt