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Authors
Abstract(s)
Gene therapy is raising as one of the most promising options for treating genetic and
acquired disorders. However, recombinant plasmid DNA (pDNA) must be recovered
from complex extracts with a diversity of biomolecules that share similar characteristics
and properties. Moreover, those biomolecules can cause immunogenicity, and their
removal is a fundamental prerequisite in preparing high-purity, stable, and biological
active pDNA for therapeutic application. To respond to this challenge and isolate pDNA
from complex extracts, a promising alternative is proposed, based on using carbon
nanotubes (CNTs). In recent years, biological applications of CNTs have been explored,
motivated by their interesting size, shape, structure, biocompatibility, and high affinity
for biomolecules.
In this work, an effective method to isolate pDNA was developed, using multi-walled
carbon nanotubes (MWCNTs) to capture proteins and other contaminating nucleic acids,
like RNA and genomic DNA (gDNA). MWCNTs with different diameters were evaluated,
while mixtures of RNA and pDNA were prepared to address the selectivity of the
material. The results of this work evidenced the ability of MWCNTs to capture RNA from
complex samples, enabling the clarification of pDNA. The results also demonstrated that
MWCNTs can reduce the amount of impurities in the first cycle of extraction, reducing
about half of the proteins, and significantly reducing the levels of genomic DNA in
solution, with a pDNA recovery rate of 86%. When performing up to three consecutive
cycles, the purity of soluble pDNA can be significantly improved.
To further reduce the environmental impact of this technology, the possibility of
recycling CNTs has also been confirmed, as well as it was assured the safety on their use
by verifying the biocompatibility of this material. Thus, attained results demonstrate the
development of a simple, efficient, and reliable method for rapid purification of pDNA
biopharmaceuticals.
A terapia genética tem-se destacado como uma das opções mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas e adquiridas. Para isso, o DNA plasmídico recombinante (pDNA) deve ser recuperado de extratos complexos cuja composição compreende uma alta diversidade de biomoléculas que partilham características e propriedades semelhantes. Além disso, estas biomoléculas podem causar imunogenicidade, aquando da administração, sendo a sua remoção um pré-requisito fundamental na preparação de pDNA estável, de alta pureza e biologicamente ativo para aplicação terapêutica. Consequentemente, a purificação de pDNA é um processo muito dispendioso para a indústria farmacêutica, e apresenta também um grande impacto para o ambiente, devido ao uso de solventes orgânicos e sais. Para responder a este desafio e isolar o pDNA de extratos complexos, é proposta uma alternativa promissora, baseada no uso de nanotubos de carbono (CNTs). Devido à sua versatilidade, os CNTs têm sido amplamente explorados em diversas áreas, sendo que, as suas propriedades únicas, como o tamanho, forma, estrutura, biocompatibilidade e elevada afinidade por biomoléculas levaram a que nos últimos anos tenham também ganho muita relevância para aplicações biológicas. Neste âmbito, o presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método eficaz para isolar o pDNA a partir de um lisado complexo de Escherichia coli, utilizando nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) para capturar proteínas e outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Primeiramente, foram avaliados diferentes diâmetros de MWCNTs (<10 nm, <10/20 nm, 20/40 nm, 60/100 nm), paralelamente à realização de ensaios de screening de adsorção e de desorção de RNA. Misturas de RNA e pDNA foram também preparadas de forma a estudar a potencial seletividade na separação destas duas biomoléculas por parte dos MWCNTs. A captura de outros contaminantes foi avaliada através da aplicação de amostras mais complexas provenientes de lisado de E. coli aos MWCNTs, seguida pela quantificação das proteínas e do gDNA presentes na amostra. Para reduzir ainda mais o impacto ambiental desta tecnologia, a possibilidade de reciclagem e reutilização dos MWCNTs foi também estudada. Os resultados deste trabalho evidenciaram a capacidade dos MWCNTs em capturar com alguma seletividade o RNA de amostras complexas, possibilitando a clarificação rápida do pDNA. Os resultados também demonstraram que os MWCNTs podem reduzir a quantidade de impurezas no primeiro ciclo de extração, reduzindo cerca de metade das proteínas, e reduzindo também significativamente os níveis de gDNA em solução, com uma taxa de recuperação de 86% de pDNA. Após 3 ciclos consecutivos, a pureza do pDNA solúvel aumentou significativamente. Por último, e de forma a averiguar a biossegurança na utilização dos MWCNTs, foi avaliada também a sua toxicidade em linhas celulares humanas, ao longo de 48 h. Através deste ensaio, ficou comprovado que os MWCNTs não apresentam qualquer toxicidade para as linhas celulares usadas, nomeadamente fibroblastos humanos. Assim, os resultados obtidos demonstram que foi possível desenvolver um método simples, eficiente e confiável para a purificação rápida de pDNA.
A terapia genética tem-se destacado como uma das opções mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas e adquiridas. Para isso, o DNA plasmídico recombinante (pDNA) deve ser recuperado de extratos complexos cuja composição compreende uma alta diversidade de biomoléculas que partilham características e propriedades semelhantes. Além disso, estas biomoléculas podem causar imunogenicidade, aquando da administração, sendo a sua remoção um pré-requisito fundamental na preparação de pDNA estável, de alta pureza e biologicamente ativo para aplicação terapêutica. Consequentemente, a purificação de pDNA é um processo muito dispendioso para a indústria farmacêutica, e apresenta também um grande impacto para o ambiente, devido ao uso de solventes orgânicos e sais. Para responder a este desafio e isolar o pDNA de extratos complexos, é proposta uma alternativa promissora, baseada no uso de nanotubos de carbono (CNTs). Devido à sua versatilidade, os CNTs têm sido amplamente explorados em diversas áreas, sendo que, as suas propriedades únicas, como o tamanho, forma, estrutura, biocompatibilidade e elevada afinidade por biomoléculas levaram a que nos últimos anos tenham também ganho muita relevância para aplicações biológicas. Neste âmbito, o presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método eficaz para isolar o pDNA a partir de um lisado complexo de Escherichia coli, utilizando nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) para capturar proteínas e outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Primeiramente, foram avaliados diferentes diâmetros de MWCNTs (<10 nm, <10/20 nm, 20/40 nm, 60/100 nm), paralelamente à realização de ensaios de screening de adsorção e de desorção de RNA. Misturas de RNA e pDNA foram também preparadas de forma a estudar a potencial seletividade na separação destas duas biomoléculas por parte dos MWCNTs. A captura de outros contaminantes foi avaliada através da aplicação de amostras mais complexas provenientes de lisado de E. coli aos MWCNTs, seguida pela quantificação das proteínas e do gDNA presentes na amostra. Para reduzir ainda mais o impacto ambiental desta tecnologia, a possibilidade de reciclagem e reutilização dos MWCNTs foi também estudada. Os resultados deste trabalho evidenciaram a capacidade dos MWCNTs em capturar com alguma seletividade o RNA de amostras complexas, possibilitando a clarificação rápida do pDNA. Os resultados também demonstraram que os MWCNTs podem reduzir a quantidade de impurezas no primeiro ciclo de extração, reduzindo cerca de metade das proteínas, e reduzindo também significativamente os níveis de gDNA em solução, com uma taxa de recuperação de 86% de pDNA. Após 3 ciclos consecutivos, a pureza do pDNA solúvel aumentou significativamente. Por último, e de forma a averiguar a biossegurança na utilização dos MWCNTs, foi avaliada também a sua toxicidade em linhas celulares humanas, ao longo de 48 h. Através deste ensaio, ficou comprovado que os MWCNTs não apresentam qualquer toxicidade para as linhas celulares usadas, nomeadamente fibroblastos humanos. Assim, os resultados obtidos demonstram que foi possível desenvolver um método simples, eficiente e confiável para a purificação rápida de pDNA.
Description
Keywords
Biofármacos Dna Plasmídico Extração de Fase Sólida Nanotubos de Carbono Rna Separação de Ácidos Nucleicos