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Authors
Abstract(s)
The therapeutic potential of RNA has been unveiled since its discovery in the beginning
of the 20th century. Notwithstanding, for RNA to be used for such applications, it has to
present high purity, integrity, and biological activity.
The recombinant production of nucleic acids is a complex process involving multiple
steps. It can be divided into upstream and downstream processing. While improvements
have been made in upstream processing, the same level of progress is not directly
observed for downstream processing.
Downstream processing, a crucial part of a bioprocess, involves the recovery,
concentration, and purification of the product from the upstream process. It
encompasses three main steps: initial recovery, high-resolution purification, and
polishing. The higher the product purity level achieved in the low-resolution purification
phase, the greater the potential for reducing high-resolution purification steps, thereby
enabling cost reduction. This is particularly important, as downstream processing
accounts for nearly 80% of the total biopharmaceutical production costs.
To advance on the current state-of-art for RNA purification, an optimization of an
adsorption method for the pre-purification of RNA when it is present in complex E. coli
lysate samples, using MDs, NDs, and functionalized NDs as adsorbents was carried out.
A simple and efficient method, using the CM that showed to be the most promising, for
the selective capture and recovery of RNA from E. coli lysates containing impurities such
as pDNA and proteins, was developed. Particularly, ND-ox were the materials that
showed to be the most promising, allowing the achievement of an adsorption capacity of
86.9 mg of RNA/g of CM, not being present pDNA in the RNA sample recovered at the
end of the procedure, and achieving an elimination of solubilized proteins of 91.28 %
relatively to the initial sample.
Globally, the results of this work demonstrated that ND-ox can be used as adsorbents in
DSPE, being capable of selectively capturing RNA and enabling its complete recovery
without contamination.
O potencial terapêutico do RNA tem vindo a ser estudado desde a sua descoberta no início do século XX. Não obstante, para que o RNA possa ser usado em tais aplicações tem de apresentar elevada pureza, integridade, assim como atividade biológica. A produção recombinante de ácidos nucleicos é um processo complexo que envolve múltiplas etapas, e pode dividir-se em processamento upstream e downstream. Embora tenham sido feitas melhorias no processamento upstream, o mesmo não se observa diretamente no processamento downstream. O processamento downstream é a parte de um bioprocesso no qual o produto obtido do processamento upstream é recuperado, concentrado e purificado. Este inclui três etapas principais: recuperação inicial ou purificação de baixa resolução, purificação de alta resolução, e polimento. Quanto maior o nível de pureza do produto após a fase de purificação de baixa resolução, maior a probabilidade de minimizar o número de passos de purificação de alta resolução, permitindo assim que haja uma redução de custos, uma vez que o processamento downstream representa cerca de 80% dos custos totais de produção de biofármacos. Para avançar no estado-de-arte atual relativo à purificação de RNA, procedeu-se a uma otimização de um método de adsorção para a pré-purificação de RNA quando este está presente em amostras complexas de lisado de E. coli, utilizando microdiamantes, nanodiamantes e nanodiamantes funcionalizados como adsorventes. Foi desenvolvido um método simples e eficiente, utilizando os materiais de carbono para a captura seletiva e recuperação de RNA de lisados de E. coli contendo impurezas como pDNA e proteínas. Em particular, os nanodiamantes oxidados foram os materiais que mostraram ser os mais promissores, permitindo alcançar uma capacidade de adsorção de 86.9 mg RNA/g de CM, não havendo presença de pDNA na amostra de RNA recuperada no final do procedimento, e atingindo uma eliminação de 91.28 % de proteínas solubilizadas da amostra recuperada relativamente à inicial. Globalmente, os resultados deste trabalho demostraram que os nanodiamantes oxidados podem ser utilizados como adsorventes em extração de fase sólida dispersiva, sendo capazes de capturar seletivamente RNA e permitindo a sua completa recuperação sem contaminação.
O potencial terapêutico do RNA tem vindo a ser estudado desde a sua descoberta no início do século XX. Não obstante, para que o RNA possa ser usado em tais aplicações tem de apresentar elevada pureza, integridade, assim como atividade biológica. A produção recombinante de ácidos nucleicos é um processo complexo que envolve múltiplas etapas, e pode dividir-se em processamento upstream e downstream. Embora tenham sido feitas melhorias no processamento upstream, o mesmo não se observa diretamente no processamento downstream. O processamento downstream é a parte de um bioprocesso no qual o produto obtido do processamento upstream é recuperado, concentrado e purificado. Este inclui três etapas principais: recuperação inicial ou purificação de baixa resolução, purificação de alta resolução, e polimento. Quanto maior o nível de pureza do produto após a fase de purificação de baixa resolução, maior a probabilidade de minimizar o número de passos de purificação de alta resolução, permitindo assim que haja uma redução de custos, uma vez que o processamento downstream representa cerca de 80% dos custos totais de produção de biofármacos. Para avançar no estado-de-arte atual relativo à purificação de RNA, procedeu-se a uma otimização de um método de adsorção para a pré-purificação de RNA quando este está presente em amostras complexas de lisado de E. coli, utilizando microdiamantes, nanodiamantes e nanodiamantes funcionalizados como adsorventes. Foi desenvolvido um método simples e eficiente, utilizando os materiais de carbono para a captura seletiva e recuperação de RNA de lisados de E. coli contendo impurezas como pDNA e proteínas. Em particular, os nanodiamantes oxidados foram os materiais que mostraram ser os mais promissores, permitindo alcançar uma capacidade de adsorção de 86.9 mg RNA/g de CM, não havendo presença de pDNA na amostra de RNA recuperada no final do procedimento, e atingindo uma eliminação de 91.28 % de proteínas solubilizadas da amostra recuperada relativamente à inicial. Globalmente, os resultados deste trabalho demostraram que os nanodiamantes oxidados podem ser utilizados como adsorventes em extração de fase sólida dispersiva, sendo capazes de capturar seletivamente RNA e permitindo a sua completa recuperação sem contaminação.
Description
Keywords
Microdiamantes Biofármacos Extração de Fase Sólida Nanodiamantes Purificação Recuperação Rna Seletividade.