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Abstract(s)
Choroid plexuses (CPs) are highly vascularized structures located at the ventricular system of the brain constituted by a monolayer of choroid plexus epithelial cells (CPEC) located on a basement membrane which form a barrier between the blood and the cerebrospinal fluid (CSF) (BCSFB). CPECs through their interconnections restrict the passage of different substances and pathogens between the blood and the CSF. Moreover, the microvilli at the apical side and an extensive infolding at the basolateral side enhance the contact between the CP epithelium and CSF, and between the epithelium and stroma interstitial fluid, respectively, thus allowing one of its main functions which is to maintain cerebral homeostasis. Among other features, there is the chemical vigilance which is performed by different mechanisms as the taste signalling, the clearance of xenobiotics, the clearance of amyloid beta and finally but with more relevance to this work, the olfactory signalling.
This olfactory cascade is activated when an odorant binds to an olfactory receptor (OR) which is a G protein-coupled receptor (GPCR) that exists in different tissues in mammalian´s body. The trace amine-associated receptors (TAARs) are a family of rhodopsin-like GPCRs which act as olfactory receptors with TAAR1 exception and are expressed in different tissues of different species. In humans there are 6 different types of TAARs and 3 pseudogenes. TAAR 13c, identified in zebrafish, can bind to cadaverine, a polyamine. Polyamines are polycations which appear naturally in cells and are closely related with neuronal cell biochemical activity at different points. Cadaverine is a diamine compound produced by the putrefaction of animal tissue and enable an aversive response to this odour. A previous data base research showed that TAAR1, 2 and 5 are the human receptors with more homology with TAAR13c and one of the more abundant TAARs in humans, which probably can trigger a response to a polyamine stimulus. TAAR1 was selected for this study because we could not amplify TAAR2 and 5 by RT-PCR in HIBCPP cell line.
The HIBCPP cell line from choroid plexus carcinoma was used to the experiments and the expression of the mRNAs to the TAAR1 was demonstrated by the RT-PCR technique. In respect to polyamine´s biosynthesis and catabolic pathway enzymes identification, the RT-PCR technique enabled the confirmation of their mRNA expression after Sanger sequencing. The expression of key enzymes to these pathways was also demonstrated by immunocytochemistry and Western blot, in human CP cell line.
To test the cell´s response to polyamines, calcium imaging (Ca2+ imaging) assays were performed and showed clear responses to cadaverine. After these tests, silencing of TAAR1 with a specific small interfering RNA (siRNA) was done and preliminary Ca2+ imaging responses to cadaverine enable to see a decrease in CP cells response, highlighting the potential role of TAAR1 in this polyamine response.
In the closer future, more silencing assays will be done and Ca2+ imaging with transfected cells will be done too with cadaverine and other polyamines already tested as spermine, spermidine and putrescine. Western blot and immunocytochemistry techniques will enable the TAAR1 protein characterization and localization in the HIBCPP cells.
No sistema nervoso central (SNC) é possível observar a presença de distintas barreiras que assumem um papel fundamental na proteção do cérebro contra as variações nas concentrações de determinadas substâncias ao nível do sangue, assim como contra a entrada de organismos patogénicos, toxinas e outras substâncias. Contudo, este nem sempre é um mecanismo de controlo favorável uma vez que estas podem funcionar como uma barreira à entrada de substâncias para o tratamento de patologias do SNC. De entre as barreiras existentes no cérebro salienta-se a barreira entre o sangue e o cérebro, a barreira aracnóideia e a barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano, o plexo coroide. O plexo coroide (CP) é uma estrutura altamente vascularizada localizada em cada um dos quatro ventrículos cerebrais. O CP é constituído por uma monocamada de células epiteliais localizada numa membrana basal e que por sua vez, formam uma barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano. Estas células, através das suas interconexões como é o caso das junções aderentes, junções apertadas e desmossomas, impedem a passagem de diferentes substâncias e organismos patogénicos, do sangue para o líquido cefalorraquidiano. Para além destas evidências, há a destacar o facto de as microvilosidades presentes na face apical assim como as invaginações existentes na superfície basal permitirem também uma boa interação entre o epitélio do plexo e o líquido cefalorraquidiano e entre o epitélio e o fluido intersticial, respetivamente, permitindo um conjugar de condições que vão assegurar uma correta manutenção da homeostase cerebral. De entre outras funções desempenhadas por esta estrutura, salienta-se a produção e secreção do líquido cefalorraquidiano e a vigilância química deste, que é assegurada por diferentes mecanismos como a sinalização gustativa, a remoção de xenobióticos, a remoção da proteína ß-amilóide, envolvida em doenças como a doença de Alzheimer, e por fim a sinalização olfativa. Esta cascata de sinalização olfativa é ativada quando uma molécula odorante se liga a um recetor olfativo, um recetor acoplado a uma proteína G. Esta ligação vai despoletar as cascatas de segundo mensageiro da adenosina monofosfato cíclica e do inositol 1,4,5-trifosfato. Há evidências de que a estimulação destes recetores olfativos ocorre pela ativação da proteína G olfativa levando a um aumento da adenosina monofosfato cíclica através da adenilato ciclase 3 de membrana, resultando num aumento do influxo de Ca2+ através de um canal nucleotídico cíclico, resultando na despolarização da membrana e consequentemente na geração de um potencial de ação nos neurónios olfativos. Os trace amine-associated receptors (TAARs) são uma família de recetores acoplados a proteína G que, à exceção do TAAR1, atuam como recetores olfativos, sendo expressos em diferentes tecidos em diferentes espécies. Diferentes estudos permitiram comprovar a expressão destes recetores em tecidos do epitélio olfativo e noutros como é o caso do cérebro, medula espinhal, coração, pulmões, fígado, baço, trato gastrointestinal, rins, testículos e células sanguíneas como os leucócitos. Em humanos é possível identificar 6 tipos diferentes de TAARs (1,2,5,6,8 e 9) e 3 pseudogenes (3, 4 e 7). Os genes que codificam para estes recetores encontram-se localizados no cromossoma 6 q23.1. O TAAR13c, expresso no peixe-zebra foi identificado como sendo o responsável por ligar à cadaverina, uma poliamina resultante da decomposição de tecidos mortos, gerada através da descarboxilação da lisina pela enzima lisina-descarboxílase, que ao ser detetada por este peixe, despoleta uma resposta aversiva por parte deste. As poliaminas são policatiões presentes em todas as células, que interagem com moléculas carregadas negativamente como é o caso do ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) ou ainda as proteínas. Estas substâncias como é o caso da cadaverina, espermina, espermidina e putrescina participam em diversas funções a nível fisiológico como o crescimento celular, proliferação, diferenciação, transcrição, tradução, regulação de canais iónicos, atividade enzimática, constituição das interações célula-célula e resposta ao stress oxidativo. Estas duas últimas funções conferem às poliaminas um papel fundamental no surgimento de diversas patologias do foro neurológico como é o caso da doença Parkinson, da esclerose lateral amiotrófica e isquemia, em que os valores destas substâncias surgem alterados. Contudo as poliaminas ao controlarem o stress oxidativo vão também ter um papel benéfico no controlo da doença de Alzheimer. Com o objetivo de estabelecer homologia entre o TAAR13c do peixe-zebra e os TAARs humanos foi realizada uma pesquisa com a ferramenta BlastX (NCBI) que revelou a existência de diferentes TAAR com maior homologia com o TAAR13c. Após uma pesquisa na base de dados Gene Expression Omnibus, foram selecionados para o estudo, os TAAR1, 2 e 5 por estes apresentarem maior abundância em humanos. Estes dados levaram-nos a supor que estes recetores teriam capacidade para despoletar uma resposta em células humanas do plexo coroide quando estimuladas por poliaminas como a cadaverina. Assim, o uso de uma linha de células humanas de carcinoma do plexo coroide, através da técnica de RT-PCR seguida de sequenciação pelo método de Sanger, permitiu identificar a expressão do mRNA para o TAAR1, o que não se verificou para os TAAR2 e 5. Um processo idêntico foi utilizado para a análise da expressão dos mRNAs para as enzimas das vias anabólica e catabólica das poliaminas, sendo a sua expressão confirmada por sequenciação. As enzimas chave destas vias, a espermina sintetase e a ornitina descarboxílase, foram também analisadas através das técnicas de Western blot e imunocitoquímica. Após a realização de um ensaio de MTT que permitiu comprovar que os estímulos de cadaverina aplicados não iriam comprometer a viabilidade celular, foram realizados ensaios de calcium imaging que possibilitaram verificar respostas por parte das células após estimulação com diferentes concentrações de cadaverina. Por forma e testar a especificidade da ligação do TAAR1 à cadaverina, foi realizado um ensaio preliminar (n=1) de silenciamento, transfetando as células com um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o TAAR1. Os resultados demonstraram uma diminuição das respostas celulares à cadaverina quando em comparação com os controlos feitos apenas com o agente de transfeção ou com este último em conjunto com um scramble siRNA. Estes resultados, embora preliminares, são promissores quanto ao papel do TAAR1 na deteção da cadaverina. Futuramente, serão realizados novos ensaios de silenciamento do TAAR1 e estímulos com outras poliaminas como a espermina, espermidina e putrescina. Serão também efetuados ensaios de Western blot e imunocitoquímica, permitindo avaliar a expressão e localização do TAAR1.
No sistema nervoso central (SNC) é possível observar a presença de distintas barreiras que assumem um papel fundamental na proteção do cérebro contra as variações nas concentrações de determinadas substâncias ao nível do sangue, assim como contra a entrada de organismos patogénicos, toxinas e outras substâncias. Contudo, este nem sempre é um mecanismo de controlo favorável uma vez que estas podem funcionar como uma barreira à entrada de substâncias para o tratamento de patologias do SNC. De entre as barreiras existentes no cérebro salienta-se a barreira entre o sangue e o cérebro, a barreira aracnóideia e a barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano, o plexo coroide. O plexo coroide (CP) é uma estrutura altamente vascularizada localizada em cada um dos quatro ventrículos cerebrais. O CP é constituído por uma monocamada de células epiteliais localizada numa membrana basal e que por sua vez, formam uma barreira entre o sangue e o líquido cefalorraquidiano. Estas células, através das suas interconexões como é o caso das junções aderentes, junções apertadas e desmossomas, impedem a passagem de diferentes substâncias e organismos patogénicos, do sangue para o líquido cefalorraquidiano. Para além destas evidências, há a destacar o facto de as microvilosidades presentes na face apical assim como as invaginações existentes na superfície basal permitirem também uma boa interação entre o epitélio do plexo e o líquido cefalorraquidiano e entre o epitélio e o fluido intersticial, respetivamente, permitindo um conjugar de condições que vão assegurar uma correta manutenção da homeostase cerebral. De entre outras funções desempenhadas por esta estrutura, salienta-se a produção e secreção do líquido cefalorraquidiano e a vigilância química deste, que é assegurada por diferentes mecanismos como a sinalização gustativa, a remoção de xenobióticos, a remoção da proteína ß-amilóide, envolvida em doenças como a doença de Alzheimer, e por fim a sinalização olfativa. Esta cascata de sinalização olfativa é ativada quando uma molécula odorante se liga a um recetor olfativo, um recetor acoplado a uma proteína G. Esta ligação vai despoletar as cascatas de segundo mensageiro da adenosina monofosfato cíclica e do inositol 1,4,5-trifosfato. Há evidências de que a estimulação destes recetores olfativos ocorre pela ativação da proteína G olfativa levando a um aumento da adenosina monofosfato cíclica através da adenilato ciclase 3 de membrana, resultando num aumento do influxo de Ca2+ através de um canal nucleotídico cíclico, resultando na despolarização da membrana e consequentemente na geração de um potencial de ação nos neurónios olfativos. Os trace amine-associated receptors (TAARs) são uma família de recetores acoplados a proteína G que, à exceção do TAAR1, atuam como recetores olfativos, sendo expressos em diferentes tecidos em diferentes espécies. Diferentes estudos permitiram comprovar a expressão destes recetores em tecidos do epitélio olfativo e noutros como é o caso do cérebro, medula espinhal, coração, pulmões, fígado, baço, trato gastrointestinal, rins, testículos e células sanguíneas como os leucócitos. Em humanos é possível identificar 6 tipos diferentes de TAARs (1,2,5,6,8 e 9) e 3 pseudogenes (3, 4 e 7). Os genes que codificam para estes recetores encontram-se localizados no cromossoma 6 q23.1. O TAAR13c, expresso no peixe-zebra foi identificado como sendo o responsável por ligar à cadaverina, uma poliamina resultante da decomposição de tecidos mortos, gerada através da descarboxilação da lisina pela enzima lisina-descarboxílase, que ao ser detetada por este peixe, despoleta uma resposta aversiva por parte deste. As poliaminas são policatiões presentes em todas as células, que interagem com moléculas carregadas negativamente como é o caso do ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) ou ainda as proteínas. Estas substâncias como é o caso da cadaverina, espermina, espermidina e putrescina participam em diversas funções a nível fisiológico como o crescimento celular, proliferação, diferenciação, transcrição, tradução, regulação de canais iónicos, atividade enzimática, constituição das interações célula-célula e resposta ao stress oxidativo. Estas duas últimas funções conferem às poliaminas um papel fundamental no surgimento de diversas patologias do foro neurológico como é o caso da doença Parkinson, da esclerose lateral amiotrófica e isquemia, em que os valores destas substâncias surgem alterados. Contudo as poliaminas ao controlarem o stress oxidativo vão também ter um papel benéfico no controlo da doença de Alzheimer. Com o objetivo de estabelecer homologia entre o TAAR13c do peixe-zebra e os TAARs humanos foi realizada uma pesquisa com a ferramenta BlastX (NCBI) que revelou a existência de diferentes TAAR com maior homologia com o TAAR13c. Após uma pesquisa na base de dados Gene Expression Omnibus, foram selecionados para o estudo, os TAAR1, 2 e 5 por estes apresentarem maior abundância em humanos. Estes dados levaram-nos a supor que estes recetores teriam capacidade para despoletar uma resposta em células humanas do plexo coroide quando estimuladas por poliaminas como a cadaverina. Assim, o uso de uma linha de células humanas de carcinoma do plexo coroide, através da técnica de RT-PCR seguida de sequenciação pelo método de Sanger, permitiu identificar a expressão do mRNA para o TAAR1, o que não se verificou para os TAAR2 e 5. Um processo idêntico foi utilizado para a análise da expressão dos mRNAs para as enzimas das vias anabólica e catabólica das poliaminas, sendo a sua expressão confirmada por sequenciação. As enzimas chave destas vias, a espermina sintetase e a ornitina descarboxílase, foram também analisadas através das técnicas de Western blot e imunocitoquímica. Após a realização de um ensaio de MTT que permitiu comprovar que os estímulos de cadaverina aplicados não iriam comprometer a viabilidade celular, foram realizados ensaios de calcium imaging que possibilitaram verificar respostas por parte das células após estimulação com diferentes concentrações de cadaverina. Por forma e testar a especificidade da ligação do TAAR1 à cadaverina, foi realizado um ensaio preliminar (n=1) de silenciamento, transfetando as células com um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o TAAR1. Os resultados demonstraram uma diminuição das respostas celulares à cadaverina quando em comparação com os controlos feitos apenas com o agente de transfeção ou com este último em conjunto com um scramble siRNA. Estes resultados, embora preliminares, são promissores quanto ao papel do TAAR1 na deteção da cadaverina. Futuramente, serão realizados novos ensaios de silenciamento do TAAR1 e estímulos com outras poliaminas como a espermina, espermidina e putrescina. Serão também efetuados ensaios de Western blot e imunocitoquímica, permitindo avaliar a expressão e localização do TAAR1.