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Parkinson’s disease is characterized by the selective loss of dopaminergic
neurons in the substantia nigra pars compacts. The aetiology of this disease is
not completely clarified; however several hypotheses have been advanced
regarding the loss of dopaminergic neurons. Among them, neuroinflammation
has been increasingly recognized as a major factor in the pathogenesis of
Parkinson’s disease, and increasing evidence suggests that microglial cells are
a predominant source of inflammation contributing for the dopaminergic
neurodegeneration. Astrocytes play vital roles in the maintenance of the normal
brain function and diverse studies suggest that they could act as physiological
regulators preventing excessive inflammatory microglial responses. However,
little is known regarding how astrocytes may modulate the microglial activation.
Due to the relevance of astrocytes-microglia interactions in the regulation of
brain inflammation, it is important to identify the mediators involved in this
process, which could act as natural anti-inflammatory agents in the brain. In this
way, the major goal of the present work was to evaluate of the effect of soluble
mediators release by astrocytes on microglial activation induced by the
inflammatory agent Zymosan A, as well as to identify the nature of these
mediators. For the determination of the effect of these molecules in the
microglial activity, ventral midbrain microglial primary cultures were previously
exposed to astrocytes conditioned media (or culture medium – control), and
then treated with 5 μg/mL ofZymosan. Studies previously made indicated that
this concentration of Zymosan provokes an accented increase of the microglia
phagocytic activity and increased ROS generation, showing no citotoxici effect
to the cells. However, the pre-incubation of the microglial cells with astrocytes
conditioned media was capable to prevent the characteristic increase of the
phagocytic activity and ROS production induced by Zymosan A, which levels
remained at control levels. To evaluate the nature of the soluble mediators
release by astrocytes able to prevent the microglial activation, specific
antibodies recognizing some neurotrophics factors known by its neuroprotectors
properties of substantia nigra. were used to block their action on the astrocytes
conditioned media. Those antibodies were: anti-GDNF, anti-CDNF and anti condicioned media, we observed that the glial cells line-derived neurotrophic
factor (GDNF) seems to be a soluble mediator capable to completely prevent
the microglial activation induced by Zymosan A, whereas, the remaining
mediators do not exerted an effect on microglial activation. To confirm this fact,
specific knockdown of GDNF was achived in astrocytes cell cultures and the
resultant condicined medium from this cultures, when applied to microglia
cultures before Zymosan A, were not capable to prevent its activation. Finally,
to clarify if this effect was an isolated of GDNF or if other molecules were laso
involved the levels of GDNF on the astrocytes conditioned media were
quntidied by ELISA assay. Based on the obtained values, three concentrations
of GDNF (100 pg/mL, 200 pg/mL and 400 pg/mL), diluted in culture medium,
were tested to verify its capability to prevent microglia activation induced by
Zymosan A. The results have shown that the three concentrations of GDNF
were capable to suppress microglial activation induced by Zymosan A.
However, the achieved protection was not in a dose dependent manner, as
initially expected.
Taken together, the results obtained in this work demonstrate that GDNF a
neurotrophic factor expressed by astrócitos, has the capacity to modulate the
microglial inflammatory response. In this way, GDNF could be use to develop a
potencial therapy to prevent neuroinflammation, and in this way contributing to
the reduction of the development of Parkinson’s Disease pathogenesis.
A doença de Parkinson é caracterizada pela perda selectiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta. A origem desta doença não está completamente esclarecida, no entanto têm sido propostas diversas hipóteses em relação aos possíveis factores envolvidos na degeneraração dos neurónios nesta zona. Entre elas, encontra-se a neuroinflamação, que é cada vez mais reconhecida como o principal factor na patogénese da doença de Parkinson, e inúmeras evidências sugerem que as células microgliais são a fonte predominante de inflamação que contribuir para a neurodegeneração dopaminérgica. Os astrócitos desempenham funções vitais na manutenção da função normal do cérebro e diversos estudos sugerem que estes podem actuar como reguladores fisiológicos prevenindo as respostas microgliais inflamatórias excessivas. No entanto, pouco se sabe sobre a forma como os astrócitos modulam a activação microglial. Dada a relevância das interacções astrócitosmicroglia na regulação da neuroinflamação, é importante identificar mediadores envolvidos neste processo, os quais podem actuar como agentes antiinflamatórios naturais no cérebro. Neste trabalho, o principal objectivo foi o estudo dos efeitos de mediadores solúveis libertados pelos astrócitos na activação microglial induzida pelo agente inflamatório Zymosan A, assim como identificar a natureza desses mediadores. Para a determinação do efeito destas moléculas na actividade microglial, culturas primárias de microglia do mesencéfalo ventral foram previamente expostas, a meio condicionado pelos astrócitos (ou meio de cultura – controlo), e posteriormente tratadas com 5 µg/mL de Zymosan A. Estudos anteriormente indicaram que esta concentração de Zymosan provoca um aumento acentuado da actividade fagocítica microglial, bem como da produção de espécies reactivas de oxigénio, sem no entanto induzir a morte destas células. No presente estudo, verificou-se que a pré-incubação das células microgliais com o meio condicionado pelos astrócitos foi capaz de prevenir o aumento da actividade microglial induzida pelo Zymosan A, mantendo a actividade fagocítica bem como os níveis de espécies reactivas de oxigénio em níveis de controlo. Para avaliar a natureza dos mediadores solúveis libertados pelos astrócitos que preveniam a activação microglial induzida pelo Zymosan A, foram usados anticorpos de forma a bloquear a acção de alguns factores neurotróficos conhecidos pelas suas propriedades neuroprotectoras na substantia nigra. Assim, o meio condicionado pelos astrócitos foi tratado com anti-GDNF, anti-CDNF e anti-BDNF, separadamente, e adicionado às culturas de microglia posteriormente expostas a Zymosan A. O factor neurotrófico derivado de células da glia (GDNF) parece ser um mediador solúvel capaz de prevenir completamente a activação microglial induzida pelo Zymosan A, sendo que os restantes mediadores parecem não exercer qualquer efeito na prevenção da activação microglial. Para confirmar este facto, silenciou-se especificamente o GDNF em culturas de astrócitos, recolhendo-se posteriormente o meio condicionado por estas culturas a aplicando-os a culturas de microglia. Este meio condicionado pelos astrócitos silenciados para o GDNF, não foi capaz de prevenir a activação microglial induzida pelo Zymosan A. Por último, para esclarecer se este efeito era directo e se não haveria outras moléculas a auxiliar o efeito exercido pelo GDNF nas células microgliais, quantificaram-se os níveis de GDNF no meio condicionado pelos astrócitos, e com base nesta quantificação, três concentrações de GDNF, 100 pg/mL, 200 pg/mL e 400 pg/mL, diluído em meio de cultura, foram testadas para avaliar os seu efeitos de prevenção da actividade microglial. Observou-se que todas as concentrações de GDNF suprimem a activação microglial induzida pelo Zymosan A. No entanto, não se verificou um efeito dose – resposta como era de esperar. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o GDNF é um factor neurotrófico derivado de astrócitos, com capacidade de modular as respostas inflamatórias microgliais. Este efeito do GDNF poderá contribuir para o desenvolvimento de uma possível terapia de prevenção contra a neuroinflamação, e indirectamente reduzir o desenvolvimento da doença de Parkinson.
A doença de Parkinson é caracterizada pela perda selectiva de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta. A origem desta doença não está completamente esclarecida, no entanto têm sido propostas diversas hipóteses em relação aos possíveis factores envolvidos na degeneraração dos neurónios nesta zona. Entre elas, encontra-se a neuroinflamação, que é cada vez mais reconhecida como o principal factor na patogénese da doença de Parkinson, e inúmeras evidências sugerem que as células microgliais são a fonte predominante de inflamação que contribuir para a neurodegeneração dopaminérgica. Os astrócitos desempenham funções vitais na manutenção da função normal do cérebro e diversos estudos sugerem que estes podem actuar como reguladores fisiológicos prevenindo as respostas microgliais inflamatórias excessivas. No entanto, pouco se sabe sobre a forma como os astrócitos modulam a activação microglial. Dada a relevância das interacções astrócitosmicroglia na regulação da neuroinflamação, é importante identificar mediadores envolvidos neste processo, os quais podem actuar como agentes antiinflamatórios naturais no cérebro. Neste trabalho, o principal objectivo foi o estudo dos efeitos de mediadores solúveis libertados pelos astrócitos na activação microglial induzida pelo agente inflamatório Zymosan A, assim como identificar a natureza desses mediadores. Para a determinação do efeito destas moléculas na actividade microglial, culturas primárias de microglia do mesencéfalo ventral foram previamente expostas, a meio condicionado pelos astrócitos (ou meio de cultura – controlo), e posteriormente tratadas com 5 µg/mL de Zymosan A. Estudos anteriormente indicaram que esta concentração de Zymosan provoca um aumento acentuado da actividade fagocítica microglial, bem como da produção de espécies reactivas de oxigénio, sem no entanto induzir a morte destas células. No presente estudo, verificou-se que a pré-incubação das células microgliais com o meio condicionado pelos astrócitos foi capaz de prevenir o aumento da actividade microglial induzida pelo Zymosan A, mantendo a actividade fagocítica bem como os níveis de espécies reactivas de oxigénio em níveis de controlo. Para avaliar a natureza dos mediadores solúveis libertados pelos astrócitos que preveniam a activação microglial induzida pelo Zymosan A, foram usados anticorpos de forma a bloquear a acção de alguns factores neurotróficos conhecidos pelas suas propriedades neuroprotectoras na substantia nigra. Assim, o meio condicionado pelos astrócitos foi tratado com anti-GDNF, anti-CDNF e anti-BDNF, separadamente, e adicionado às culturas de microglia posteriormente expostas a Zymosan A. O factor neurotrófico derivado de células da glia (GDNF) parece ser um mediador solúvel capaz de prevenir completamente a activação microglial induzida pelo Zymosan A, sendo que os restantes mediadores parecem não exercer qualquer efeito na prevenção da activação microglial. Para confirmar este facto, silenciou-se especificamente o GDNF em culturas de astrócitos, recolhendo-se posteriormente o meio condicionado por estas culturas a aplicando-os a culturas de microglia. Este meio condicionado pelos astrócitos silenciados para o GDNF, não foi capaz de prevenir a activação microglial induzida pelo Zymosan A. Por último, para esclarecer se este efeito era directo e se não haveria outras moléculas a auxiliar o efeito exercido pelo GDNF nas células microgliais, quantificaram-se os níveis de GDNF no meio condicionado pelos astrócitos, e com base nesta quantificação, três concentrações de GDNF, 100 pg/mL, 200 pg/mL e 400 pg/mL, diluído em meio de cultura, foram testadas para avaliar os seu efeitos de prevenção da actividade microglial. Observou-se que todas as concentrações de GDNF suprimem a activação microglial induzida pelo Zymosan A. No entanto, não se verificou um efeito dose – resposta como era de esperar. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o GDNF é um factor neurotrófico derivado de astrócitos, com capacidade de modular as respostas inflamatórias microgliais. Este efeito do GDNF poderá contribuir para o desenvolvimento de uma possível terapia de prevenção contra a neuroinflamação, e indirectamente reduzir o desenvolvimento da doença de Parkinson.
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Keywords
Doença de Parkinson Microglia Astrócitos Neuroinflamação