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Advisor(s)
Abstract(s)
Cancer is a major health issue for the worldwide population. It is the second most common cause of death in developed countries. According to the World Health Organization (WHO; 2018), 1 in 6 deaths occurs as a result of this disease. This scenario occurs due to the limited effectiveness of the currently available treatments, namely chemotherapy, radiotherapy and surgery. To overcome such drawbacks, the medical/scientific community as well as the pharmaceutical companies have been effortfully pursuing the development of new cancer treatments exhibiting a higher efficacy.
Before the new drugs can be used in the clinic, they must fulfill all the requirements established by the regulatory agencies, namely by the Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicine Agency (EMA). The initial assessment of anticancer agents’ efficacy is performed through in vitro and in vivo assays (preclinical studies). This preclinical stage includes physicochemical and biological characterization of the compounds as well as their safety and toxic profile, by using cells and animals.
The 2D cell cultures, i.e. cells grown as a monolayer on artificial flat plastic surfaces, are the most common in vitro model used for drug development purposes. These cell culture models are easy to handle, cost-effective and display a good reproducibility. However, they are unable to fully predict the effect of therapeutic agents in in vivo tumors. Due to that, a huge number of compounds showing effectiveness in 2D cell culture models fail when tested in in vivo models. This drawback leads to an over-use of animals in experimentation, and also contributes to increase the time and the overall cost of the drug development process.
The limitations presented by 2D cell cultures result from their inability to mimic the characteristics of the in vivo tumor tissues, specially their cellular organization and function. Therefore, it is crucial to screen anticancer agents in in vitro models that can better represent the features of solid tumors affecting humans. Sphere-like tightly bound cellular aggregates, known as spheroids, are in vitro 3D cell culture models that reproduce closely the complexity of cancerous human tissues. Such is owed to the fact that spheroids display inherent metabolic (oxygen, carbon dioxide, nutrients and waste) gradients like those found in poorly vascularized tumors. Such gradients endow spheroids a cellular similar organization to that exhibited by solid tumors, i.e. three main cellular layers composed of an external layer of proliferative cells, an intermediate layer formed by quiescence cells and an inner acidic and hypoxic layer comprised of necrotic cells. On the other hand, compared to 2D cell cultures, spheroids demonstrate increased cell-cell interactions, as well as ECM proteins deposition and cell-ECM interactions. Despite of the potential of 3D tumor spheroids for drug screening purposes, their use is still scarce. In one hand, spheroids’ production techniques that can be used to form spheroids (e.g. Liquid Overlay Technique (LOT) and Hanging Drop Technique) demand optimization for allowing the production of spheroids under highly reproducible conditions. On the other hand, the analysis of the therapeutics’ effect on spheroids is still challenging, due to the limited availability of protocols, techniques and equipment required to perform such assays. Particularly, although the fluorescence microscopy is one of the most used techniques to assess the therapeutics distribution within the spheroids or the cellular death in response to a potential therapeutic, some fluorescence microscopes are not suitable for the imaging of spheroids.
The imaging of spheroids by confocal fluorescence microscopy modalities is challenging due to spheroids’ thickness and to the light scattering phenomenon. When light cross a biological sample, it is scattered due to the refractive index (RI) mismatches between acellular and cellular constituents. Due to this fact, the excitation light is dispersed through the sample, thus limiting its penetration into the deepest regions of spheroids. Therefore, it is challenging to obtain high-resolution images of intact spheroids, specially from their interior.
Having this in mind, the main objective of this thesis’ work plan was to address the limitations of spheroids imaging by confocal laser scanning microscopy (CLSM). To achieve this goal, optical clearing methods, namely ClearT and ClearT2, that were previously applied for the imaging of animals’ biological samples, were optimized for spheroids analysis. These methods were used to reduce the light scattering phenomenon in the spheroids by performing the homogenization of the spheroids overall RI, to accomplish an improved spheroids’ transparency and a light penetration depth.
In the first experimental study that was performed within the scope of this thesis, the ClearT optical clear method was, from the best of my knowledge, used for the first time for spheroids’ analysis. To accomplish that, spheroids were cleared by immersing them on solutions with increasing concentrations of formamide. The obtained results demonstrated that the ClearT method did not affect the structure of the spheroids and improved the PI signal penetration depth by about 43%. Additionally, ClearT also enhanced the cells imaging within the spheroid by increasing the imaging cross-section depth by 47% (at 100 μm of depth in the Z-axis).
In the second study, the ClearT2 optical clearing method was investigated and optimized for the analysis of spheroids. The ClearT2 protocol involves the immersion of the samples in aqueous solutions with increasing concentrations of formamide and polyethylene glycol (PEG). Herein, it was investigated for the first time the influence of PEG molecular weight on ClearT2 method ability to clear spheroids. For this purpose, several PEG molecular weights were investigated, namely 4000, 8000 and 10000 Da. The obtained results demonstrated that the ClearT2 method enhances spheroids’ transparency and contributes to preserve the PI fluorescence intensity for all the PEG MW used. Further, the ClearT2 method performed using PEG 4000 Da allowed a better PI signal penetration depth (up to 212 μm in the Z-axis) and an enhanced of the cross-section depth (about 26% more than that of the non-cleared spheroids at a penetration depth of 100 μm).
Overall, the obtained results demonstrate that the ClearT and ClearT2 methods were able to improve the CLSM imaging of PI stained spheroids. Furthermore, these methods may also contribute for the development of new anticancer treatments, since they may be used for the evaluation of the cellular death within spheroids prompted by therapeutics and even for the analysis of drugs distribution and dispersion within spheroids as well as to perform the analysis of the expression of specific fluorescent proteins in spheroids.
O cancro é atualmente uma das doenças com maior incidência na população mundial, sendo que uma em cada seis mortes ocorre como consequência desta doença, de acordo com os dados da Organização Mundial de Saúde (2018). Nos países desenvolvidos, esta doença é a segunda maior causa de morte, sendo apenas superada pelas doenças cardiovasculares (p.ex. cardiopatia isquémica). A elevada taxa de mortalidade associada ao cancro advém da reduzida eficácia e das limitações das terapias normalmente utilizadas na clínica, nomeadamente a quimioterapia, radioterapia e cirurgia. As limitações destas abordagens terapêuticas têm despoletado junto da indústria farmacêutica, da comunidade médica e científica a necessidade de desenvolver novos agentes anticancerígenos. Todos os compostos desenvolvidos para aplicações terapêuticas devem ser cuidadosamente estudados e avaliados de acordo com as normas das agências reguladoras, tais como Food and Drug Administration (FDA) e a Agência Europeia de Medicamentos (EMA), antes de poderem ser usados em meio clínico. Para atingir este objetivo, os compostos são primeiramente avaliados em ensaios pré-clínicos, onde são usados modelos in vitro (células) e in vivo (animais), e posteriormente em ensaios clínicos (humanos). Neste contexto, os modelos in vitro são fundamentais numa fase inicial para se proceder à avaliação da eficácia terapêutica dos compostos, assim como para reduzir o número de animais utilizados em laboratório, que é uma das principais reivindicações de diferentes organizações, nomeadamente da European Partnership for Alternative Approaches to Animal Testing (EPAA). O modelo in vitro mais usado para a avaliação da eficácia terapêutica de novos compostos é a cultura de células em 2D, i.e. o crescimento de células em monocamada sobre uma superfície plana de plástico (p. ex. poliestireno). Este tipo de cultura celular é atrativo devido ao seu fácil manuseamento, reduzido custo e elevada reprodutibilidade. Contudo, as culturas celulares 2D não conseguem prever com exatidão a ação dos fármacos nos tumores. Deste modo, uma grande percentagem dos compostos que apresentam resultados promissores nos ensaios in vitro não demonstram a mesma eficácia terapêutica nos ensaios in vivo. Estes resultados são explicados pelo facto destes modelos celulares não conseguirem mimetizar a organização estrutural e funcional dos tumores. Com o intuito de ultrapassar as limitações das culturas celulares 2D, durante as últimas décadas, a proliferação de células em 3D tem sido um dos tópicos mais investigado. Na atualidade, este tipo de cultura é realizado em estruturas artificiais que reproduzem a matriz extracelular dos tecidos humanos. Para além disso, a cultura de células em 3D pode também ser efetuada sob a forma de agregados celulares, usando técnicas como a Liquid Overlay Technique (LOT) e Hanging Drop Technique. Estes agregados celulares são conhecidos por esferoides e vários estudos têm demonstrado que estes mimetizam de uma forma aproximada as características dos tumores que afetam os seres humanos, nomeadamente os tumores sólidos. À semelhança do que ocorre nestes tumores, os esferoides apresentam um gradiente de gases e nutrientes. As células que se encontram na camada exterior do esferoide têm acesso facilitado a nutrientes e a oxigénio, enquanto que as células presentes nas regiões mais internas possuem um acesso limitado (hipóxia). Deste modo, a taxa de proliferação das células diminui da periferia para o interior do esferoide, sendo o interior destes agregados constituído por células necróticas. Em comparação com as culturas celulares 2D, os esferoides apresentam ainda um maior número de interações célula-célula, célula-matriz e uma elevada deposição de proteínas da matriz extracelular. Apesar dos diferentes estudos já efetuados, as culturas celulares 3D têm tido uma contribuição marginal para o desenvolvimento de novos fármacos anticancerígenos. Este facto deve-se à necessidade de otimizar os métodos de produção de esferoides de forma a obter agregados celulares de forma reprodutível e em larga escala. Por outro lado, a maioria dos protocolos e equipamentos usados na avaliação de compostos em culturas celulares estão apenas otimizados para a análise de células cultivadas em monocamada. A avaliação da eficácia terapêutica de compostos nos esferoides tem sido essencialmente monitorizada através de microscopia ótica, microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, western blot, entre outras técnicas. A microscopia de fluorescência tem sido uma das técnicas mais usadas para efetuar este tipo de análise, no entanto, alguns dos microscópios de fluorescência não possuem as características adequadas para a visualização dos esferoides. Por outro lado, a microscopia confocal de fluorescência não permite a aquisição de imagens de amostras com elevada espessura. Este facto deve-se à dispersão da luz que ocorre quando esta atravessa os constituintes celulares e não celulares dos esferoides (p.ex. água, proteínas, lípidos, entre outros), que possuem índices de refração diferentes. Em consequência deste fenómeno, a luz usada para excitar a amostra é dispersa e não atinge todas as partes do esferoide, como o seu interior. O plano de trabalhos desenvolvido durante o meu doutoramento teve como objetivo melhorar a aquisição de imagens dos esferoides por microscopia de confocal de fluorescência. Para tal, foram usados métodos de clareamento ótico, nomeadamente o ClearT e o ClearT2. Estes métodos permitem reduzir a dispersão da luz nos esferoides através da homogeneização do índice de refração dos seus constituintes. Após o processo de clareamento, os esferoides tornam-se mais transparentes, o que permite uma maior penetração da luz e, simultaneamente, a aquisição de imagens mais completas dos esferoides. No primeiro estudo experimental realizado no âmbito do meu doutoramento, foi utilizado pela primeira vez o método ClearT para efetuar o clareamento ótico dos esferoides. Este método envolveu a imersão dos agregados celulares em soluções de concentração crescente de formamida. Os resultados obtidos demonstraram que o método ClearT permite tornar os esferoides mais transparentes sem influenciar a sua estrutura, uma vez que o tamanho dos esferoides não é significativamente alterado após o seu clareamento. Por outro lado, a aplicação do método ClearT não diminui significativamente a intensidade de fluorescência do iodeto de propídio comparativamente com os esferoides não clareados. Simultaneamente, a profundidade da deteção do sinal do iodeto de propídio no eixo do Z foi melhorada em cerca de 43%. Para além disso, foram ainda registadas melhorias na deteção de fluorescência no interior dos esferoides, sendo que a uma distância de 100 μm no eixo do Z foi possível detetar mais 47% do sinal de iodeto de propídio. No segundo estudo realizado, procedeu-se à otimização do método ClearT2 para a análise de esferoides. Este método baseia-se na imersão das amostras em soluções aquosas com concentrações crescentes de formamida e polietilenoglicol (PEG). Para alcançar os objetivos definidos foram realizados os métodos denominados por ClearT2/4, ClearT2/8 e ClearT2/10 usando PEG com 4000, 8000 e 10000 Da, com o intuito de determinar qual destes é o mais eficiente para alcançar o clareamento ótico dos esferoides. Os resultados obtidos demonstraram que independentemente do peso molecular do PEG, todas as variações do método ClearT2 permitiram obter esferoides transparentes sem que o tamanho original destes fosse afetado. Para além disto, todas as variantes do método ClearT2 permitiram que a intensidade de sinal do iodeto de propídio não fosse reduzida após a aplicação do processo de clareamento. Em particular, o método ClearT2/4 permitiu incrementar significativamente a intensidade de fluorescência proveniente dos esferoides marcados com iodeto de propídio (a intensidade de fluorescência foi incrementada em cerca de 120% comparativamente com os esferoides não clareados). Para além disto, o método ClearT2/4 foi aquele que permitiu obter imagens dos esferoides a uma maior profundidade no eixo Z (até 212 μm), assim como um sinal de fluorescência mais intenso no interior dos esferoides (26%). Com base nos resultados obtidos pode concluir-se que ambos os métodos ClearT e ClearT2 podem ser usados para melhorar a aquisição de imagens de esferoides marcados com iodeto de propídio através de microscopia confocal de fluorescência. Por outro lado, estes métodos poderão contribuir para o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos, uma vez que estes podem ser usados para permitir a avaliação da morte celular em esferoides após a administração de agentes anticancerígenos. Adicionalmente, estes métodos poderão também permitir a análise da penetração e distribuição de fármacos ou nanopartículas, assim como avaliar a expressão de proteínas específicas nos esferoides através de microscopia de fluorescência.
O cancro é atualmente uma das doenças com maior incidência na população mundial, sendo que uma em cada seis mortes ocorre como consequência desta doença, de acordo com os dados da Organização Mundial de Saúde (2018). Nos países desenvolvidos, esta doença é a segunda maior causa de morte, sendo apenas superada pelas doenças cardiovasculares (p.ex. cardiopatia isquémica). A elevada taxa de mortalidade associada ao cancro advém da reduzida eficácia e das limitações das terapias normalmente utilizadas na clínica, nomeadamente a quimioterapia, radioterapia e cirurgia. As limitações destas abordagens terapêuticas têm despoletado junto da indústria farmacêutica, da comunidade médica e científica a necessidade de desenvolver novos agentes anticancerígenos. Todos os compostos desenvolvidos para aplicações terapêuticas devem ser cuidadosamente estudados e avaliados de acordo com as normas das agências reguladoras, tais como Food and Drug Administration (FDA) e a Agência Europeia de Medicamentos (EMA), antes de poderem ser usados em meio clínico. Para atingir este objetivo, os compostos são primeiramente avaliados em ensaios pré-clínicos, onde são usados modelos in vitro (células) e in vivo (animais), e posteriormente em ensaios clínicos (humanos). Neste contexto, os modelos in vitro são fundamentais numa fase inicial para se proceder à avaliação da eficácia terapêutica dos compostos, assim como para reduzir o número de animais utilizados em laboratório, que é uma das principais reivindicações de diferentes organizações, nomeadamente da European Partnership for Alternative Approaches to Animal Testing (EPAA). O modelo in vitro mais usado para a avaliação da eficácia terapêutica de novos compostos é a cultura de células em 2D, i.e. o crescimento de células em monocamada sobre uma superfície plana de plástico (p. ex. poliestireno). Este tipo de cultura celular é atrativo devido ao seu fácil manuseamento, reduzido custo e elevada reprodutibilidade. Contudo, as culturas celulares 2D não conseguem prever com exatidão a ação dos fármacos nos tumores. Deste modo, uma grande percentagem dos compostos que apresentam resultados promissores nos ensaios in vitro não demonstram a mesma eficácia terapêutica nos ensaios in vivo. Estes resultados são explicados pelo facto destes modelos celulares não conseguirem mimetizar a organização estrutural e funcional dos tumores. Com o intuito de ultrapassar as limitações das culturas celulares 2D, durante as últimas décadas, a proliferação de células em 3D tem sido um dos tópicos mais investigado. Na atualidade, este tipo de cultura é realizado em estruturas artificiais que reproduzem a matriz extracelular dos tecidos humanos. Para além disso, a cultura de células em 3D pode também ser efetuada sob a forma de agregados celulares, usando técnicas como a Liquid Overlay Technique (LOT) e Hanging Drop Technique. Estes agregados celulares são conhecidos por esferoides e vários estudos têm demonstrado que estes mimetizam de uma forma aproximada as características dos tumores que afetam os seres humanos, nomeadamente os tumores sólidos. À semelhança do que ocorre nestes tumores, os esferoides apresentam um gradiente de gases e nutrientes. As células que se encontram na camada exterior do esferoide têm acesso facilitado a nutrientes e a oxigénio, enquanto que as células presentes nas regiões mais internas possuem um acesso limitado (hipóxia). Deste modo, a taxa de proliferação das células diminui da periferia para o interior do esferoide, sendo o interior destes agregados constituído por células necróticas. Em comparação com as culturas celulares 2D, os esferoides apresentam ainda um maior número de interações célula-célula, célula-matriz e uma elevada deposição de proteínas da matriz extracelular. Apesar dos diferentes estudos já efetuados, as culturas celulares 3D têm tido uma contribuição marginal para o desenvolvimento de novos fármacos anticancerígenos. Este facto deve-se à necessidade de otimizar os métodos de produção de esferoides de forma a obter agregados celulares de forma reprodutível e em larga escala. Por outro lado, a maioria dos protocolos e equipamentos usados na avaliação de compostos em culturas celulares estão apenas otimizados para a análise de células cultivadas em monocamada. A avaliação da eficácia terapêutica de compostos nos esferoides tem sido essencialmente monitorizada através de microscopia ótica, microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, western blot, entre outras técnicas. A microscopia de fluorescência tem sido uma das técnicas mais usadas para efetuar este tipo de análise, no entanto, alguns dos microscópios de fluorescência não possuem as características adequadas para a visualização dos esferoides. Por outro lado, a microscopia confocal de fluorescência não permite a aquisição de imagens de amostras com elevada espessura. Este facto deve-se à dispersão da luz que ocorre quando esta atravessa os constituintes celulares e não celulares dos esferoides (p.ex. água, proteínas, lípidos, entre outros), que possuem índices de refração diferentes. Em consequência deste fenómeno, a luz usada para excitar a amostra é dispersa e não atinge todas as partes do esferoide, como o seu interior. O plano de trabalhos desenvolvido durante o meu doutoramento teve como objetivo melhorar a aquisição de imagens dos esferoides por microscopia de confocal de fluorescência. Para tal, foram usados métodos de clareamento ótico, nomeadamente o ClearT e o ClearT2. Estes métodos permitem reduzir a dispersão da luz nos esferoides através da homogeneização do índice de refração dos seus constituintes. Após o processo de clareamento, os esferoides tornam-se mais transparentes, o que permite uma maior penetração da luz e, simultaneamente, a aquisição de imagens mais completas dos esferoides. No primeiro estudo experimental realizado no âmbito do meu doutoramento, foi utilizado pela primeira vez o método ClearT para efetuar o clareamento ótico dos esferoides. Este método envolveu a imersão dos agregados celulares em soluções de concentração crescente de formamida. Os resultados obtidos demonstraram que o método ClearT permite tornar os esferoides mais transparentes sem influenciar a sua estrutura, uma vez que o tamanho dos esferoides não é significativamente alterado após o seu clareamento. Por outro lado, a aplicação do método ClearT não diminui significativamente a intensidade de fluorescência do iodeto de propídio comparativamente com os esferoides não clareados. Simultaneamente, a profundidade da deteção do sinal do iodeto de propídio no eixo do Z foi melhorada em cerca de 43%. Para além disso, foram ainda registadas melhorias na deteção de fluorescência no interior dos esferoides, sendo que a uma distância de 100 μm no eixo do Z foi possível detetar mais 47% do sinal de iodeto de propídio. No segundo estudo realizado, procedeu-se à otimização do método ClearT2 para a análise de esferoides. Este método baseia-se na imersão das amostras em soluções aquosas com concentrações crescentes de formamida e polietilenoglicol (PEG). Para alcançar os objetivos definidos foram realizados os métodos denominados por ClearT2/4, ClearT2/8 e ClearT2/10 usando PEG com 4000, 8000 e 10000 Da, com o intuito de determinar qual destes é o mais eficiente para alcançar o clareamento ótico dos esferoides. Os resultados obtidos demonstraram que independentemente do peso molecular do PEG, todas as variações do método ClearT2 permitiram obter esferoides transparentes sem que o tamanho original destes fosse afetado. Para além disto, todas as variantes do método ClearT2 permitiram que a intensidade de sinal do iodeto de propídio não fosse reduzida após a aplicação do processo de clareamento. Em particular, o método ClearT2/4 permitiu incrementar significativamente a intensidade de fluorescência proveniente dos esferoides marcados com iodeto de propídio (a intensidade de fluorescência foi incrementada em cerca de 120% comparativamente com os esferoides não clareados). Para além disto, o método ClearT2/4 foi aquele que permitiu obter imagens dos esferoides a uma maior profundidade no eixo Z (até 212 μm), assim como um sinal de fluorescência mais intenso no interior dos esferoides (26%). Com base nos resultados obtidos pode concluir-se que ambos os métodos ClearT e ClearT2 podem ser usados para melhorar a aquisição de imagens de esferoides marcados com iodeto de propídio através de microscopia confocal de fluorescência. Por outro lado, estes métodos poderão contribuir para o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos, uma vez que estes podem ser usados para permitir a avaliação da morte celular em esferoides após a administração de agentes anticancerígenos. Adicionalmente, estes métodos poderão também permitir a análise da penetração e distribuição de fármacos ou nanopartículas, assim como avaliar a expressão de proteínas específicas nos esferoides através de microscopia de fluorescência.
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Keywords
Anatomia celular - Células tumorais Anatomia celular - Células cultivadas - Esferoides Esferoides - Clareamento ótico - ClearT - Clear T2 Esferoides - Microscopia de confocal de fluorescência