Publicação
Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small aromatic molecules
| dc.contributor.advisor | Tomaz, Cândida Ascensão Teixeira | |
| dc.contributor.advisor | Almeida, Paulo Jorge da Silva | |
| dc.contributor.advisor | Marcos, João Carlos Ramos Nunes | |
| dc.contributor.author | Nunes, Catarina Caramelo | |
| dc.date.accessioned | 2015-05-14T09:11:35Z | |
| dc.date.available | 2015-05-14T09:11:35Z | |
| dc.date.issued | 2013-10 | |
| dc.description.abstract | Molecular therapies are gaining importance as an effective therapeutic approach for various types of diseases. The most efficient vectors used to introduce the therapeutic genes are of viral origin however, non-viral vectors based on pDNA are gaining popularity due to their superior safety and easy of production. These factors have increased the demand for high quantities of pharmaceutical grade plasmid DNA (pDNA). Therefore, the research for more efficient pDNA purification protocols has also increased. Moreover, the final pDNA product must meet stringent quality criteria established by the regulatory agencies. Liquid chromatography is the method of choice for the purification of pDNA, since it is simple, robust, versatile and high reproducible. The most important features of a chromatographic procedure are the use of suitable stationary phases and ligands. As conventional purification protocols are being replaced by more sophisticated and selective procedures, the focus changes towards designing and selecting ligands of high affinity and specificity. In fact, the chemical composition of the chromatographic supports determines the interactions established with the target molecules, allowing their preferential retention over the undesirable ones. With these facts in mind, the aim of this work was to develop new chromatographic methods for the purification of pharmaceutical grade pDNA, with the purpose of improving the overall procedures to more effective, simple, economic and environmental-friendly ones. The minor groove binder berenil and the intercalator 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP) where chosen to be used as ligands in pDNA chromatographic purification studies. They were immobilized to an epoxy-activated Sepharose matrix using a relatively mild curing method, without a catalyst and with quite small ligand:Sepharose weight ratios. Berenil binds pDNA preferentially through hydrophobic interactions but other types of interaction contributions cannot be neglected. It was shown to be quite effective at separating and purifying pDNA from clarified and non-clarified cell lysates, using three different approaches, although isoform resolution was not obtained in either case. Using mild amounts of ammonium sulphate in the eluent, berenil-Sepharose support was able to purify distinct pDNA of two different sizes from clarified cell lysates. Moreover, the ability was continual when the clarification process was replaced by a second chromatographic run. In all cases plasmid solutions were in accordance to the specifications of a pharmaceutical product, however the yields were quite different: two consecutive chromatographic runs lead to lower recoveries (33%) and smaller pDNA molecules have higher recoveries using one run through the column (85% vs 45%). A negative chromatography approach was also performed with berenil-Sepharose, showing some advantages in terms of salt usage as well as procedure time. In this case the recovery yield was quite good (87%) and although pDNA solutions had a comparable purity to that obtained with the other approaches, the gDNA reduction was not so effective. DAPP is slightly A-T specific and binds DNA through non-covalent, reversible stacking interactions of the condensed aromatic moiety into two successive base pairs, while the phenyl residue gets inserted into the minor groove. In addition, protonated DAPP molecules bind to DNA much strongly due to the generation of strong electrostatic interactions. Plasmid DNA binding to DAPP-Sepharose varies with pH and is affected by the presence of salt in the eluent. In fact, total retention of clarified lysate components was only possible with a pH below DAPP's free state pKa (5.8) and the presence of salt destabilizes that same retention. So, the elution of bound species was simply performed by adding small amounts of sodium chloride to the buffers. These features were successfully applied for purification of sc pDNA with two distinct sizes that were obtained according to the regulatory agencies specifications. Once more, the recovery yield of the smaller pDNA molecule was higher than the one obtained for the largest one (94% vs 65%). In conclusion, DAPP-Sepharose showed exceptional characteristics to be used as an affinity support for the purification of pharmaceutical grade sc pDNA. In comparison with berenil- Sepharose, it uses much smaller amounts of salt, with less economic and environmental impact, while improving the quality and yield of the obtained plasmid fractions. Moreover, it is able to separate sc pDNA from linear and oc isoforms even in complex lysates. Moreover, combining DAPP-Sepharose chromatography with other optimized production, extraction and clarification procedures, can offer a number of advantages for pharmaceutical pDNA purification. Also, since the most significant disadvantage of this DAPP-Sepharose support is the relatively low capacity for pDNA, which in turn is strongly related to the solid matrix used, other more stable stationary phases with low pressure drops and interconnected macropores, that allow a high mass transfer of solutes, are quite fascinating alternatives. | por |
| dc.description.abstract | As terapias moleculares que se baseiam na prevenção e tratamento de doenças por transferência genética, estão a tornar-se fortes alternativas aos tratamentos clássicos. A administração dos genes terapêuticos é feita recorrendo a veículos ou vetores que podem ser de origem viral ou não viral. Presentemente, os vetores virais ainda são considerados os mais eficientes para a administração genética, contudo os vetores baseados em DNA plasmídico (pDNA) estão a ganhar popularidade devido à sua simplicidade de produção e segurança, sendo o terceiro tipo de vetor mais usado em ensaios clínicos. Desta forma, a investigação relacionada com novos métodos para a obtenção de quantidades substanciais de pDNA de grau terapêutico tem aumentado bastante. O pDNA para fins terapêuticos deve estar em conformidade com as especificações das agências reguladoras, seguindo rigorosos critérios de qualidade em termos de uso de reagentes tóxicos ou de origem animal, bem como de pureza relativamente aos restantes constituintes dos lisados celulares. Contudo, as semelhanças existentes entre o pDNA e os seus contaminantes comuns, como proteínas, endotoxinas, DNA genómico e RNA, podem complicar a sua separação, pelo que o processo de purificação deverá ser extremamente eficiente. A cromatografia líquida é o método mais utilizado para a purificação de pDNA, uma vez que é um processo relativamente simples, robusto, versátil e altamente reprodutível. Os métodos cromatográficos exploram propriedades do pDNA como tamanho, hidrofobicidade, carga e a afinidade das suas bases aos ligandos, para o separar das suas impurezas com a maior eficiência possível. A flexibilidade deste tipo de processo advém da grande variedade de suportes e ligandos que podem ser usados, tendo em conta as especificidades da molécula a separar. A identificação e seleção de ligandos de elevada seletividade e afinidade é presentemente uma prioridade no desenvolvimento de novos processos cromatográficos. De facto, a composição química dos suportes determina as interações estabelecidas com as moléculas alvo, permitindo uma interação preferencial com estas em detrimento das moléculas contaminantes. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi desenvolver novos métodos cromatográficos para a purificação de pDNA de grau terapêutico, com o propósito de implementar métodos mais eficientes, mais simples, com menor custo e menor impacto ambiental. O ligando de "minor groove" berenil e o intercalante 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP) foram as moléculas escolhidas para serem testadas como ligandos cromatográficos. Ambos foram imobilizados numa matriz de Sepharose epoxi-ativada, em condições moderadas, sem recorrer a catalisador e com rácios de ligando:Sepharose relativamente baixos. O berenil estabelece ligações não covalentes reversíveis com as bases do DNA, preferencialmente ao nível das sequências A-T. Liga-se principalmente através de interações hidrofóbicas, contudo, outras interações como as electrostáticas, van der Waals e pontes de hidrogénio não podem ser negligenciadas. Com quantidades moderadas de sulfato de amónio no eluente, a matriz berenil-Sepharose mostrou ser bastante eficaz na separação e purificação de pDNA presente em lisados clarificados e não clarificados, usando três métodos distintos. Contudo, a separação da isoforma superenrolada das restantes não foi conseguida em nenhum dos casos. Porém, se a solução injetada for constituída por uma mistura purificada das isoformas superenrolada e circular aberta, estas são facilmente separadas. Usando o suporte berenil-Sepharose foi possível purificar dois plasmídeos de diferentes tamanhos a partir de lisados clarificados contendo cada uma deles. O mesmo se verificou quando o processo de clarificação foi substituído por um segundo passo cromatográfico. Em ambos os casos, as soluções de pDNA obtidas estavam de acordo com as especificações exigidas para um produto com aplicações terapêuticas. No entanto, os rendimentos obtidos apresentaram algumas diferenças importantes: os dois ensaios cromatográficos consecutivos originaram rendimentos relativamente baixos (33%), enquanto no método cromatográfico associado a um passo de clarificação foi obtido um rendimento superior para o pDNA de menor tamanho relativamente ao de maior dimensão (85% vs 45%). Estudos de cromatografia negativa foram também realizados com este suporte, os quais demonstraram algumas vantagens em termos de quantidade de sal utilizado e tempo total do método. Neste caso, o rendimento obtido foi bastante bom (87%) mas, apesar de as soluções de pDNA terem graus de pureza semelhantes às obtidas por cromatografia positiva, a redução da contaminação de DNA genómico não se revelou tão eficiente. As moléculas de DAPP têm alguma especificidade para com as sequências A-T e ligam-se ao pDNA por introdução reversível e não covalente dos anéis aromáticos condensados entre dois pares de bases consecutivos, enquanto o grupo fenilo se introduz no "minor groove". Tal sugere que as interações hidrofóbicas têm um papel importante na ligação. Contudo, quando as moléculas de DAPP estão protonadas, estas ligam-se ao pDNA de forma muito mais forte devido ao estabelecimento de fortes interações electrostáticas. A ligação do pDNA à matriz DAPP-Sepharose é influenciada por variações de pH e pela presença de sal nas fases líquidas. Na verdade, a retenção total de todos os constituintes do lisado clarificado injetado só foi possível a um pH inferior ao pKa da molécula de DAPP (5,8), verificando-se que a presença de sal destabiliza essa mesma retenção. Assim, a eluição das espécies retidas foi facilmente conseguida por adição de pequenas quantidades de cloreto de sódio ao eluente. Todas estas características permitiram a purificação com sucesso de pDNA superenrolado, de diferentes massas moleculares, o qual foi obtido de acordo com as especificações das agências reguladoras. Uma vez mais, o rendimento para o pDNA de menor tamanho ultrapassou em muito o do pDNA de maiores dimensões (94% vs 65%). A capacidade dinâmica de ligação ao pDNA obtida para o suporte DAPP-Sepharose foi de 336,75 µg pDNA/mL gel, um valor aceitável considerando que é um suporte não comercial, com uma densidade de ligandos relativamente baixa (0,15 mmol DAPP/g Sepharose derivatizada). Para além disso, a constante de dissociação (2,29 ± 0,195 x 10-7 M) constitui uma evidência importante de que esta matriz apresenta uma elevada afinidade para com o pDNA. Em conclusão, o DAPP-Sepharose apresenta as características ideais para ser aplicado como suporte de afinidade na purificação de pDNA superenrolado de grau farmacêutico. Em comparação com a fase estacionária de berenil-Sepharose, usa quantidades de sal muito menores, tendo portanto um impacto económico e ambiental menor, ao mesmo tempo que permite a obtenção de pDNA com melhor qualidade e rendimento mais elevado. Para além disso, também permite a separação da isoforma superenrolada da linear e circular aberta, mesmo a partir de lisados complexos. Desta forma, combinar um passo cromatográfico, usando o suporte DAPP-Sepharose, com processos optimizados de produção, extração e clarificação, pode ser extremamente vantajoso para a produção de pDNA. Para além disso, uma vez que a maior desvantagem deste suporte é a sua baixa capacidade para com o pDNA, que por sua vez está diretamente relacionada com a matriz usada, será extremamente interessante usar, como alternativa, outras matrizes mais estáveis e com macroporos interconectados que permitam uma elevada transferência de massa dos solutos. | por |
| dc.description.sponsorship | Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) | por |
| dc.identifier.tid | 101319649 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.6/3340 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.relation | Bolsa de Doutoramento FCT: Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small antibiotic molecules [SFRH/BD/64918/2009] | |
| dc.relation | Affinity Interactions between Cyanine Dyes and Biomolecules in Chromatographic Processes [PTDC/QUI-QUI/100896/2008] | |
| dc.relation | Strategic Project - UI 709 - 2011-2012 [PEst-C/SAU/UI0709/2011] | |
| dc.subject | Cromatografia de afinidade | por |
| dc.subject | Purificação de plasmídeos | por |
| dc.subject | Purificação de DNA | por |
| dc.subject | Berenit-Sepharose | por |
| dc.subject | DAPP-Sepharose | por |
| dc.title | Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small aromatic molecules | por |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | SFRH/BD/64918/2009 | |
| oaire.awardNumber | PTDC/QUI-QUI/100896/2008 | |
| oaire.awardNumber | PEst-C/SAU/UI0709/2011 | |
| oaire.awardTitle | Bolsa de Doutoramento FCT: Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small antibiotic molecules [SFRH/BD/64918/2009] | |
| oaire.awardTitle | Affinity Interactions between Cyanine Dyes and Biomolecules in Chromatographic Processes [PTDC/QUI-QUI/100896/2008] | |
| oaire.awardTitle | Strategic Project - UI 709 - 2011-2012 [PEst-C/SAU/UI0709/2011] | |
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