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Abstract(s)
The increased use of biopharmaceutical-based treatments shows the need for the
development of efficient chromatographic techniques to purify specific biomolecules
such as nucleic acids, enzymes, or monoclonal antibodies. These biomolecules are
increasingly being employed in clinical trials and there are also several examples of
approved biodrugs by the Food and Drug Administration (FDA). The unique chemical
and structural characteristics that these biomolecules possess are crucial for developing
suitable chromatographic materials. Until now, achieving complete control over the
properties of chromatographic matrices and ensuring their consistent structure and
packing has been a challenge. As a result, the slightly varied internal structure and porous
configuration pose challenges in anticipating their chromatographic performance. This
obligates to rigorous testing and validation of the packed chromatographic supports to
ensure their quality before utilization.
In this context, three-dimensional (3D) printing has been gaining recognition as
a set of promising technologies for the production of chromatographic supports, with
numerous advantages compared to traditional manufacturing methods. Among these
advantages, there is the total control over the geometry of the produced piece, the design
flexibility, one-step production, and the ability to easily conduct computational
simulations on the desired geometry, such as simulating chromatographic runs (as the
object is printed based on a computer model). Depending on specific requirements,
various 3D printing processes can be employed, offering a variety of surface qualities and
high dimensional precision. Although 3D printing can enhance the performance of
chromatographic structures in terms of geometric standardization and efficient flow,
these properties alone cannot guarantee the production of high-quality
biopharmaceutical products. Therefore, it is necessary to modify them with ligands that
ensure specific binding between the chromatographic matrix and the target molecule,
ensuring high levels of purity and recovery of this molecule. Thus, in this work, Tyrosine
was used as an affinity ligand. It possesses an aromatic ring and a hydroxyl group,
making it suitable for participating in interactions in affinity chromatography,
potentially serving to capture and purify biomolecules endowed with precise binding
attributes. These biomolecules may include antibodies, enzymes, or DNA, and can
selectively interact with tyrosine ligands. Within affinity chromatography, tyrosine
ligands engage in intricate encounters with target molecules. These interactions unfold
through a complex interplay of hydrophobic forces, hydrogen bonding, and other noncovalent interactions. These interactions rely on the distinct affinity that target molecules have for tyrosine, ultimately enabling the process of meticulous and selective binding,
followed by purification.
With this in mind, 3D printing was employed in this study to produce
chromatographic supports with reproducible geometry, which were subsequently
functionalized with Tyrosine. The experiments conducted in this study can be divided
into four tasks: (1) Production of the 3D Printed chromatographic structure; (2) Tyrosine
immobilization on the chromatographic support; (3) Assessment of the stability of the
bonding between the ligand and the chromatographic support when subjected to
different chromatographic conditions to assess the robustness of these new prototypes;
(4) Binding experiments conducted with pDNA samples to understand the interaction
profile of the developed matrices with this target molecule.
O aumento da utilização de biofármacos destaca a necessidade de se desenvolverem técnicas cromatográficas eficientes para purificar biomoléculas específicas, como ácidos nucleicos, enzimas ou anticorpos monoclonais. Estas biomoléculas estão a ser cada vez mais usadas em ensaios clínicos ou foram até já aprovadas por agências reguladoras como a Food and Drug Administration (FDA). As características químicas e estruturais únicas de cada tipo de biomolécula são cruciais para o desenvolvimento de materiais cromatográficos adequados. Até agora, alcançar um controlo completo sobre as propriedades das matrizes cromatográficas e garantir a sua estrutura e empacotamento consistentes tem sido um desafio. Como resultado, a ligeira variação na estrutura interna e na configuração porosa coloca desafios na antecipação do desempenho cromatográfico, o que faz com que exista a necessidade de se realizarem testes e validações rigorosas dos suportes cromatográficos empacotados para garantir a sua qualidade antes da utilização. Neste sentido a impressão tridimensional (3D) tem vindo a ganhar créditos como um conjunto de tecnologias promissoras para a produção de suportes cromatográficos, com inúmeras vantagens em comparação com os métodos tradicionais de fabrico. De entre estas vantagens podem salientar-se o controlo total da geometria da peça produzida, a flexibilidade de design, a produção num único passo e a possibilidade de facilmente se realizarem simulações computacionais na geometria desejada de forma a simular, por exemplo, as corridas cromatográficas (uma vez que o objeto é impresso com base num modelo computacional). Dependendo dos requisitos específicos, podem ser usados diversos processos de impressão 3D, oferecendo uma variedade de propriedades de superfície e alta precisão dimensional. Embora a impressão 3D possa melhorar o desempenho das estruturas cromatográficas ao nível da normalização da geometria ou de escoamento eficiente, por si só estas propriedades não conseguem garantir a produção de produtos farmacêuticos de alta qualidade. Deste modo torna-se necessário o acoplamento de ligandos que garantam a interação específica entre a matriz cromatográfica e a molécula alvo de forma que se garantam altos níveis de pureza e recuperação desta molécula. Desta forma, neste trabalho foi utilizada a Tirosina como ligando de afinidade, que possui um anel aromático e um grupo hidroxilo, tornando-o adequado para participar em interações na cromatografia de afinidade, podendo servir para capturar e purificar biomoléculas. Estas biomoléculas que podem incluir anticorpos, enzimas ou DNA, poderão interagir seletivamente com os ligandos de tirosina. No âmbito da cromatografia de afinidade, os ligandos de tirosina estão envolvidos em contatos específicos com moléculas-alvo. Estas interações desenvolvem-se através de uma complexa integração de interações hidrofóbicas, ligações de hidrogénio e outras interações não covalentes. Estas ligações dependem da afinidade distinta que as moléculas alvo têm pela tirosina, permitindo, em última análise, o processo de ligação meticuloso e seletivo, seguido de purificação. Posto isto, neste trabalho foi utilizada impressão 3D para produzir suportes cromatográficos com uma geometria reprodutível sendo estes, posteriormente, funcionalizados com tirosina. Os ensaios realizados no presente trabalho podem ser divididos em 4 partes: (1) Produção da estrutura cromatográfica impressa em 3D; (2) Imobilização da tirosina no suporte cromatográfico; (3) Avaliação da estabilidade da ligação entre o ligando e o suporte cromatográfico quando sujeito a diferentes condições cromatográficas para avaliar a resistência, robustez e estabilidade destes novos protótipos; (4) Ensaios de ligação realizados com amostras de DNA plasmídico para compreender o perfil de interação das matrizes desenvolvidas com essa molécula alvo.
O aumento da utilização de biofármacos destaca a necessidade de se desenvolverem técnicas cromatográficas eficientes para purificar biomoléculas específicas, como ácidos nucleicos, enzimas ou anticorpos monoclonais. Estas biomoléculas estão a ser cada vez mais usadas em ensaios clínicos ou foram até já aprovadas por agências reguladoras como a Food and Drug Administration (FDA). As características químicas e estruturais únicas de cada tipo de biomolécula são cruciais para o desenvolvimento de materiais cromatográficos adequados. Até agora, alcançar um controlo completo sobre as propriedades das matrizes cromatográficas e garantir a sua estrutura e empacotamento consistentes tem sido um desafio. Como resultado, a ligeira variação na estrutura interna e na configuração porosa coloca desafios na antecipação do desempenho cromatográfico, o que faz com que exista a necessidade de se realizarem testes e validações rigorosas dos suportes cromatográficos empacotados para garantir a sua qualidade antes da utilização. Neste sentido a impressão tridimensional (3D) tem vindo a ganhar créditos como um conjunto de tecnologias promissoras para a produção de suportes cromatográficos, com inúmeras vantagens em comparação com os métodos tradicionais de fabrico. De entre estas vantagens podem salientar-se o controlo total da geometria da peça produzida, a flexibilidade de design, a produção num único passo e a possibilidade de facilmente se realizarem simulações computacionais na geometria desejada de forma a simular, por exemplo, as corridas cromatográficas (uma vez que o objeto é impresso com base num modelo computacional). Dependendo dos requisitos específicos, podem ser usados diversos processos de impressão 3D, oferecendo uma variedade de propriedades de superfície e alta precisão dimensional. Embora a impressão 3D possa melhorar o desempenho das estruturas cromatográficas ao nível da normalização da geometria ou de escoamento eficiente, por si só estas propriedades não conseguem garantir a produção de produtos farmacêuticos de alta qualidade. Deste modo torna-se necessário o acoplamento de ligandos que garantam a interação específica entre a matriz cromatográfica e a molécula alvo de forma que se garantam altos níveis de pureza e recuperação desta molécula. Desta forma, neste trabalho foi utilizada a Tirosina como ligando de afinidade, que possui um anel aromático e um grupo hidroxilo, tornando-o adequado para participar em interações na cromatografia de afinidade, podendo servir para capturar e purificar biomoléculas. Estas biomoléculas que podem incluir anticorpos, enzimas ou DNA, poderão interagir seletivamente com os ligandos de tirosina. No âmbito da cromatografia de afinidade, os ligandos de tirosina estão envolvidos em contatos específicos com moléculas-alvo. Estas interações desenvolvem-se através de uma complexa integração de interações hidrofóbicas, ligações de hidrogénio e outras interações não covalentes. Estas ligações dependem da afinidade distinta que as moléculas alvo têm pela tirosina, permitindo, em última análise, o processo de ligação meticuloso e seletivo, seguido de purificação. Posto isto, neste trabalho foi utilizada impressão 3D para produzir suportes cromatográficos com uma geometria reprodutível sendo estes, posteriormente, funcionalizados com tirosina. Os ensaios realizados no presente trabalho podem ser divididos em 4 partes: (1) Produção da estrutura cromatográfica impressa em 3D; (2) Imobilização da tirosina no suporte cromatográfico; (3) Avaliação da estabilidade da ligação entre o ligando e o suporte cromatográfico quando sujeito a diferentes condições cromatográficas para avaliar a resistência, robustez e estabilidade destes novos protótipos; (4) Ensaios de ligação realizados com amostras de DNA plasmídico para compreender o perfil de interação das matrizes desenvolvidas com essa molécula alvo.
Description
Keywords
Cromatografia de Afinidade Dna Plasmídico Fabricação
Aditiva Fdm Impressão 3d Suportes Cromatográficos Tirosina