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Authors
Abstract(s)
Human Papillomaviruses (HPVs) are among the most common sexually transmitted infectious agents. The infectious virus particles (virions) invade and replicate in dividing cells, hijack their host cellular process, and new virions are released in terminally differentiated cells, in the uppermost layers of the epithelium. The immune system usually clears the virus, but on some occasions the infection remains and can induce proliferation alterations, leading to the development of warts. Although, high-risk HPVs, namely HPV16 and HPV18, can also cause malignant transformations, being considered etiological agents of cervical or head and neck cancers.
Currently, there are HPV screening and vaccination programs that contributed for a reduction in the infections prevalence by up to 85% for the genotypes covered by the vaccines, and a 50% reduction in the number of high grade lesions related to this virus, particularly in countries with high vaccination rates (≥50%). Although, they are still limited in some countries, as well as in men, which together with the prophylactic nature contribute for HPV remaining a worldwide health issue. Adding to this, the available therapeutic approaches have limited efficacy and cause several side effects, with a great impact on patients’ quality of life. Therefore, there is still investigation for the development of new treatment options for HPV-related cancers.
In the pursuit of new therapeutic options, nanoparticles are being proposed as efficient delivery method. Many of them take advantage of passive targeting, which facilitates nanoparticles deposition in tumor cells, owing to some characteristics of the tumor milieu, such as the enhanced permeability of the vasculature. Although, this permeability varies between individuals, and internalization by other organs can occur, reducing the therapeutic efficacy and inducing nonspecific effects. Thus, targeting strategies are being employed to enhance the nanoparticles selectivity towards cancer cells, reducing potential off-target effects. To achieve this, biorecognition molecules are attached to the nanoparticles surface. For instance, nucleic acids can be used, such as the internalizing RNA previously developed by Magalhães et al., 2012, that shown promising results as a strategy for the development and enhancement of novel RNA-based transfection methods. On the other hand, DNA aptamers are also a promising approach due to their high selectivity towards a specific target that can be a protein or a whole cell. Particularly, G-quadruplex aptamers are emerging, due to their increased stability and higher negative charge density comparingly to duplex DNA, favoring the interactions with cationic proteins. The most well-known and used example is AS1411 with nucleolin as target, a protein that is overexpressed in cancer cells surface. To achieve better structural or antiproliferative results, derivatives of AS1411 were more recently proposed.
Thus, in this thesis, new nanotherapeutic approaches for HPV-related cancers were investigated and functionalization with different targeting moieties (AS1411 and derivatives or an internalizing RNA) was tested. The nanosystems were developed for a more selective delivery of different small molecules, including the drugs imiquimod or dexamethasone and the potential therapeutic molecule C8 (10-(8-(4-iodobenzamide) octyl)-3,6-bis (dimethylamine) acridinium iodide).
Firstly, the targeting capacity of AS1411 derivatives (namely AT11, AT11-Bo and AT11-L0) was investigated and these sequences were used for a more selective delivery of Zn(II) phthalocyanine (ZnPc) derivatives. The supramolecular aggregates composed by the aptamers and ZnPc derivatives were more cytotoxic in HPV cancer cells (HeLa cells), relatively to the non-malignant NHDF cells (<40% versus ~80%). These findings support the development of new strategies using these sequences for an improved anticancer effect of the therapeutic molecules.
Then, different nanosystems were tested in HPV-integrated cervical, namely HeLa (HPV18+), CaSki (HPV16+ and HPV18+) and SiHa (HPV16+), or head and neck UPCI-SCC-154 (HPV16+) cancer cell lines and, in the final part of the work, in HPV16 transgenic mice. At first, gold nanoparticles functionalized with AS1411, with a known improved cancer cells uptake, were tested as a potential drug delivery system of imiquimod or C8. The obtained drug delivery systems were produced, characterized, evaluated and incorporated in a gel formulation, prepared based on the universal placebo formulation. As proposed, the AS1411-functionalized gold nanoparticles were indeed capable of improving the selectivity (decreasing the therapeutic molecules cytotoxicity in the non-malignant cells, NHDF cells; cell viabilities >60%) and to potentiate their anticancer effect, especially in HeLa cells (cell viabilities <30%). Additionally, when in a formulation, the C8 ligand was able to permeate and be retained in ex vivo porcine vaginal tissues.
To achieve higher biocompatibility, the work was further moved to lipid nanoparticles, aiming to improve the potential clinical applicability of the produced drug delivery systems. First, liposomes produced by the thin film hydration method were obtained and functionalized with a promising internalizing RNA. The RNA was firstly biophysically characterized to analyze the effect of intermolecular interactions with C8 or dexamethasone, in which it was observed that these molecules do not induce alterations in its structure and thermal stability. Then, the produced liposomes were also characterized and biologically evaluated. Overall, the liposomes improved the selectivity of the used therapeutic molecules towards the tongue cancer cell line, UPCI-SCC-154 (~13/37% versus >85%). Although, this production method resulted in low amounts of liposomal suspension (<1 mL of suspension at <1 mg/mL of lipids, per batch). For this reason, we changed to the ethanol injection method, which resulted in larger volumes of liposomal suspension (~10 mL of suspension at 3.56 mg/mL of lipids) and faster (from ~3 days to ~1 h up to the obtention of the functionalized liposomes), being more compatible with a bulk manufacturing process. Thus, liposomes were produced and functionalized by a post-insertion method with AT11 and were used to deliver imiquimod or C8. The obtained liposomes shown to be cancer-selective and with an effective anticancer effect in the UPCI-SCC-154 cell line, reducing the viability, proliferation, migration, invasion and inducing cancer cells death. The AT11-functionalized liposomes with C8 were then incorporated in gel formulations, prepared based on the universal placebo, with or without essential oils (Thymus vulgaris or Origanum vulgare). The formulations presented suitable features for application (including high viscosities, 968-1318 mPa.s, and osmolality <1200 mOsmol/kg), the essential oils potentiate the anticancer effect in cervical cancer cell lines (HeLa, SiHa and CaSki) and after application in healthy or HPV16 transgenic mice, it was confirmed that the produced formulation was safe and with potential therapeutic effect in HPV-associated lesions.
Overall, different nanotherapeutic strategies were proposed to enhance drug delivery towards HPV-related cervical and head and neck cancers, which highlight the great potential of nanomedicine in cancer treatment. While there is still considerable progress to be made, this work provides valuable insights into potential new targeting moieties and therapeutic molecules.
Os vírus do papiloma humano (VPHs) estão entre os agentes infeciosos mais comumente transmitidos por via sexual. As partículas virais infeciosas (designadas por viriões) invadem, replicam e sequestram células na fase inicial da proliferação celular e novos viriões são libertados pelas células na fase final da diferenciação celular, em camadas epiteliais mais superficiais. O sistema imunológico geralmente elimina o vírus, mas, em algumas situações, a infeção permanece e pode induzir alterações na proliferação celular, levando ao desenvolvimento de verrugas. No entanto, os VPHs de alto risco, nomeadamente do tipo 16 e 18, podem induzir transformações malignas, sendo até considerados agentes etiológicos dos cancros do colo do útero, da cabeça e do pescoço. Atualmente, existem programas de rastreio e vacinação contra os VPHs que contribuíram para uma redução de até 85% na prevalência de infeções pelos genótipos presentes nas vacinas e de até 50% na incidência de lesões de alto grau resultantes da infeção por estes vírus, nomeadamente em países com elevadas taxas de vacinação (≥50%). No entanto, a sua implementação em alguns países, bem como a adesão da população masculina continua a ser reduzida, o que, juntamente com a natureza profilática das vacinas, contribui para que a infeção persistente por VPHs continue a ser um grave problema de saúde pública. Para além disso, as abordagens terapêuticas disponíveis têm eficácia limitada e vários efeitos secundários associados, causando um impacto significativo na qualidade de vida dos doentes. Desta forma, continua a ser fundamental a investigação para o desenvolvimento de novas opções de tratamento para os cancros resultantes da infeção persistente por VPHs. Na tentativa de aumentar as abordagens terapêuticas existentes para estes cancros, novas estratégias baseadas em nanopartículas estão a ser desenvolvidas e estudadas para uma entrega mais eficaz de fármacos/ligandos. Devido a características presentes no microambiente tumoral, nomeadamente a permeabilidade aumentada da vasculatura, algumas nanopartículas são internalizadas de forma passiva e tendem a acumular-se nas células tumorais. Porém, a permeabilidade da vasculatura varia entre indivíduos e pode também ocorrer internalização não específica por outros órgãos, acabando por reduzir a eficácia terapêutica das nanopartículas e induzir toxicidade inespecífica. Neste sentido, e de forma a ultrapassar estas limitações, estratégias de direcionamento têm sido investigadas como uma alternativa para promover uma entrega ativa e seletiva das nanopartículas para as células cancerígenas, minimizando possíveis efeitos adversos. O direcionamento ativo é alcançado pela funcionalização da superfície das nanopartículas com moléculas capazes de reconhecer células ou proteínas de interesse. Neste contexto, podem ser usados ácidos nucleicos, como por exemplo o ARN previamente descrito por Magalhães et al., 2012, que apresentou resultados promissores para o desenvolvimento e otimização de novos métodos de transfeção. Alternativamente, aptameros de ADN são uma abordagem promissora devido à sua elevada seletividade para um alvo específico, que pode consistir numa proteína ou célula. Em particular, os aptameros de G-quadruplex têm maior estabilidade e densidade de carga negativa comparativamente com o ADN de dupla hélice, favorecendo interações com proteínas catiónicas. O exemplo mais conhecido e usado é o AS1411 que tem como alvo a nucleolina, uma proteína que se encontra sobreexpressa à superfície de células cancerígenas. Mais recentemente, com o objetivo de melhorar os seus resultados estruturais e antiproliferativos, vários derivados de AS1411 foram propostos. Nesta tese foram investigadas potenciais novas abordagens nanoterapêuticas para os cancros do colo do útero ou da cabeça e do pescoço associados a VPHs (nomeadamente ao VPH16 ou 18) e foi testada a sua funcionalização com três ácidos nucleicos (AS1411, AT11 ou um ARN), com o objetivo de direcionar as nanopartículas para as células cancerígenas. Os nanossistemas foram desenvolvidos para entregar moléculas terapêuticas, incluindo os fármacos imiquimod ou dexametasona, e o ligando C8 (iodeto de 10-(8-(4-iodobenzamida) octil) -3,6-bis (dimetilamina) acridínio). Numa primeira fase, foi investigada a capacidade de direcionamento dos derivados do AS1411 (nomeadamente o AT11, AT11-B0 e AT11-L0) para uma entrega mais seletiva de derivados de ftalocianina de Zn(II) (ZnPc). Os agregados supramoleculares resultantes foram mais citotóxicos nas células cancerígenas do colo do útero (HeLa) comparativamente à linha celular não maligna (NHDF; <40% versus ~80%). Estes resultados suportam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas com base nestas sequências de ADN para um efeito anticancerígeno mais seletivo. De seguida, diferentes nanossistemas foram testados em linhas celulares do cancro do colo do útero, nomeadamente nas células HeLa (VPH18+), CaSki (VPH16+ e VPH18+) e SiHa (VPH16+) ou da cabeça e do pescoço, mais concretamente as células UPCI-SCC-154 (VPH16+) e, na fase final do trabalho, em murganhos transgénicos para VPH16. Inicialmente, nanopartículas de ouro funcionalizadas com AS1411, capazes de acumular seletivamente em células cancerígenas, foram testadas como potenciais sistema de entrega de imiquimod ou C8. Estas foram preparadas, caracterizadas, avaliadas e incorporadas numa formulação em gel, preparada com base no placebo universal. As nanopartículas de ouro funcionalizadas com AS1411 melhoraram a seletividade (diminuindo a citotoxicidade das moléculas terapêuticas nas células não malignas; viabilidades celulares >60%) e potenciaram o efeito anticancerígeno do imiquimod nas células cancerígenas, especialmente nas HeLa (viabilidades celulares <30%). Adicionalmente, o C8 em formulação foi capaz de permear e ficar retido em tecidos epiteliais ex vivo excisados a partir de vaginas suínas. O trabalho foi posteriormente direcionado para a produção de nanopartículas lipídicas, devido à sua maior biocompatibilidade, com o objetivo de melhorar a potencial aplicabilidade clínica dos sistemas de entrega. Primeiramente, os lipossomas preparados pelo método de hidratação de camada fina foram funcionalizados com um ARN. Este ARN foi inicialmente caracterizado por técnicas biofísicas para avaliar estrutura e interações com o C8 ou a dexametasona, onde se verificou que estas moléculas não induziam alterações na sua estrutura e estabilidade térmica. Seguidamente, os lipossomas produzidos foram caracterizados e avaliados biologicamente. De forma geral, estes melhoraram a seletividade das moléculas terapêuticas para a linha cancerígena da língua UPCI-SCC-154 (~13/37% versus >85%). No entanto, este método de produção resultou em baixos rendimentos de suspensão lipossomal (<1 mL da suspensão com lípidos a <1 mg/mL). Por este motivo, o método foi alterado para o de injeção etanólica, que permitiu a obtenção de maiores quantidades de suspensão de lipossomas (~10 mL de suspensão com lípidos a 3,56 mg/mL) e de forma mais rápida (passando de ~3 dias para ~1 hora até à obtenção do lipossoma funcionalizado com a molécula de direcionamento), sendo mais compatível com um processo de produção em larga escala. Os lipossomas produzidos por injeção etanólica foram funcionalizados pelo método de pós-inserção com AT11 e usados para entregar imiquimod ou C8. Estes mostraram ser seletivos na linha celular UPCI-SCC-154, reduzindo a viabilidade, proliferação, migração, invasão e induzindo a sua morte. Os lipossomas funcionalizados com o AT11 e com o C8 associado foram posteriormente incorporados numa formulação em gel, preparada com base no placebo universal e com ou sem óleos essenciais obtidos de Thymus vulgaris ou Origanum vulgare. As formulações mostraram características adequadas (nomeadamente altas viscosidades, 968-1318 mPa.s, e osmolalidades <1200 mOsmol/kg) para aplicação tópica, os óleos essenciais potenciaram o efeito anticancerígeno em linhas do cancro do colo do útero (HeLa, SiHa e CaSki) e, após aplicação em murganhos saudáveis ou transgénicos para o VPH16, confirmou-se que a formulação produzida, com óleo essencial obtido de Thymus vulgaris e com a incorporação de lipossomas com C8 associado e funcionalizados com AT11, foi segura e com potencial efeito terapêutico em lesões resultantes do VPH16. Em suma, diferentes nanossistemas foram propostos para melhorar a entrega de moléculas terapêuticas aos cancros do colo do útero e da cabeça e do pescoço com VPHs integrados, o que realça o potencial da nanomedicina no tratamento do cancro. Embora seja necessária mais investigação, até uma possível aplicação em doentes, este trabalho fornece informações sobre potenciais novas estratégias de direcionamento e moléculas terapêuticas.
Os vírus do papiloma humano (VPHs) estão entre os agentes infeciosos mais comumente transmitidos por via sexual. As partículas virais infeciosas (designadas por viriões) invadem, replicam e sequestram células na fase inicial da proliferação celular e novos viriões são libertados pelas células na fase final da diferenciação celular, em camadas epiteliais mais superficiais. O sistema imunológico geralmente elimina o vírus, mas, em algumas situações, a infeção permanece e pode induzir alterações na proliferação celular, levando ao desenvolvimento de verrugas. No entanto, os VPHs de alto risco, nomeadamente do tipo 16 e 18, podem induzir transformações malignas, sendo até considerados agentes etiológicos dos cancros do colo do útero, da cabeça e do pescoço. Atualmente, existem programas de rastreio e vacinação contra os VPHs que contribuíram para uma redução de até 85% na prevalência de infeções pelos genótipos presentes nas vacinas e de até 50% na incidência de lesões de alto grau resultantes da infeção por estes vírus, nomeadamente em países com elevadas taxas de vacinação (≥50%). No entanto, a sua implementação em alguns países, bem como a adesão da população masculina continua a ser reduzida, o que, juntamente com a natureza profilática das vacinas, contribui para que a infeção persistente por VPHs continue a ser um grave problema de saúde pública. Para além disso, as abordagens terapêuticas disponíveis têm eficácia limitada e vários efeitos secundários associados, causando um impacto significativo na qualidade de vida dos doentes. Desta forma, continua a ser fundamental a investigação para o desenvolvimento de novas opções de tratamento para os cancros resultantes da infeção persistente por VPHs. Na tentativa de aumentar as abordagens terapêuticas existentes para estes cancros, novas estratégias baseadas em nanopartículas estão a ser desenvolvidas e estudadas para uma entrega mais eficaz de fármacos/ligandos. Devido a características presentes no microambiente tumoral, nomeadamente a permeabilidade aumentada da vasculatura, algumas nanopartículas são internalizadas de forma passiva e tendem a acumular-se nas células tumorais. Porém, a permeabilidade da vasculatura varia entre indivíduos e pode também ocorrer internalização não específica por outros órgãos, acabando por reduzir a eficácia terapêutica das nanopartículas e induzir toxicidade inespecífica. Neste sentido, e de forma a ultrapassar estas limitações, estratégias de direcionamento têm sido investigadas como uma alternativa para promover uma entrega ativa e seletiva das nanopartículas para as células cancerígenas, minimizando possíveis efeitos adversos. O direcionamento ativo é alcançado pela funcionalização da superfície das nanopartículas com moléculas capazes de reconhecer células ou proteínas de interesse. Neste contexto, podem ser usados ácidos nucleicos, como por exemplo o ARN previamente descrito por Magalhães et al., 2012, que apresentou resultados promissores para o desenvolvimento e otimização de novos métodos de transfeção. Alternativamente, aptameros de ADN são uma abordagem promissora devido à sua elevada seletividade para um alvo específico, que pode consistir numa proteína ou célula. Em particular, os aptameros de G-quadruplex têm maior estabilidade e densidade de carga negativa comparativamente com o ADN de dupla hélice, favorecendo interações com proteínas catiónicas. O exemplo mais conhecido e usado é o AS1411 que tem como alvo a nucleolina, uma proteína que se encontra sobreexpressa à superfície de células cancerígenas. Mais recentemente, com o objetivo de melhorar os seus resultados estruturais e antiproliferativos, vários derivados de AS1411 foram propostos. Nesta tese foram investigadas potenciais novas abordagens nanoterapêuticas para os cancros do colo do útero ou da cabeça e do pescoço associados a VPHs (nomeadamente ao VPH16 ou 18) e foi testada a sua funcionalização com três ácidos nucleicos (AS1411, AT11 ou um ARN), com o objetivo de direcionar as nanopartículas para as células cancerígenas. Os nanossistemas foram desenvolvidos para entregar moléculas terapêuticas, incluindo os fármacos imiquimod ou dexametasona, e o ligando C8 (iodeto de 10-(8-(4-iodobenzamida) octil) -3,6-bis (dimetilamina) acridínio). Numa primeira fase, foi investigada a capacidade de direcionamento dos derivados do AS1411 (nomeadamente o AT11, AT11-B0 e AT11-L0) para uma entrega mais seletiva de derivados de ftalocianina de Zn(II) (ZnPc). Os agregados supramoleculares resultantes foram mais citotóxicos nas células cancerígenas do colo do útero (HeLa) comparativamente à linha celular não maligna (NHDF; <40% versus ~80%). Estes resultados suportam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas com base nestas sequências de ADN para um efeito anticancerígeno mais seletivo. De seguida, diferentes nanossistemas foram testados em linhas celulares do cancro do colo do útero, nomeadamente nas células HeLa (VPH18+), CaSki (VPH16+ e VPH18+) e SiHa (VPH16+) ou da cabeça e do pescoço, mais concretamente as células UPCI-SCC-154 (VPH16+) e, na fase final do trabalho, em murganhos transgénicos para VPH16. Inicialmente, nanopartículas de ouro funcionalizadas com AS1411, capazes de acumular seletivamente em células cancerígenas, foram testadas como potenciais sistema de entrega de imiquimod ou C8. Estas foram preparadas, caracterizadas, avaliadas e incorporadas numa formulação em gel, preparada com base no placebo universal. As nanopartículas de ouro funcionalizadas com AS1411 melhoraram a seletividade (diminuindo a citotoxicidade das moléculas terapêuticas nas células não malignas; viabilidades celulares >60%) e potenciaram o efeito anticancerígeno do imiquimod nas células cancerígenas, especialmente nas HeLa (viabilidades celulares <30%). Adicionalmente, o C8 em formulação foi capaz de permear e ficar retido em tecidos epiteliais ex vivo excisados a partir de vaginas suínas. O trabalho foi posteriormente direcionado para a produção de nanopartículas lipídicas, devido à sua maior biocompatibilidade, com o objetivo de melhorar a potencial aplicabilidade clínica dos sistemas de entrega. Primeiramente, os lipossomas preparados pelo método de hidratação de camada fina foram funcionalizados com um ARN. Este ARN foi inicialmente caracterizado por técnicas biofísicas para avaliar estrutura e interações com o C8 ou a dexametasona, onde se verificou que estas moléculas não induziam alterações na sua estrutura e estabilidade térmica. Seguidamente, os lipossomas produzidos foram caracterizados e avaliados biologicamente. De forma geral, estes melhoraram a seletividade das moléculas terapêuticas para a linha cancerígena da língua UPCI-SCC-154 (~13/37% versus >85%). No entanto, este método de produção resultou em baixos rendimentos de suspensão lipossomal (<1 mL da suspensão com lípidos a <1 mg/mL). Por este motivo, o método foi alterado para o de injeção etanólica, que permitiu a obtenção de maiores quantidades de suspensão de lipossomas (~10 mL de suspensão com lípidos a 3,56 mg/mL) e de forma mais rápida (passando de ~3 dias para ~1 hora até à obtenção do lipossoma funcionalizado com a molécula de direcionamento), sendo mais compatível com um processo de produção em larga escala. Os lipossomas produzidos por injeção etanólica foram funcionalizados pelo método de pós-inserção com AT11 e usados para entregar imiquimod ou C8. Estes mostraram ser seletivos na linha celular UPCI-SCC-154, reduzindo a viabilidade, proliferação, migração, invasão e induzindo a sua morte. Os lipossomas funcionalizados com o AT11 e com o C8 associado foram posteriormente incorporados numa formulação em gel, preparada com base no placebo universal e com ou sem óleos essenciais obtidos de Thymus vulgaris ou Origanum vulgare. As formulações mostraram características adequadas (nomeadamente altas viscosidades, 968-1318 mPa.s, e osmolalidades <1200 mOsmol/kg) para aplicação tópica, os óleos essenciais potenciaram o efeito anticancerígeno em linhas do cancro do colo do útero (HeLa, SiHa e CaSki) e, após aplicação em murganhos saudáveis ou transgénicos para o VPH16, confirmou-se que a formulação produzida, com óleo essencial obtido de Thymus vulgaris e com a incorporação de lipossomas com C8 associado e funcionalizados com AT11, foi segura e com potencial efeito terapêutico em lesões resultantes do VPH16. Em suma, diferentes nanossistemas foram propostos para melhorar a entrega de moléculas terapêuticas aos cancros do colo do útero e da cabeça e do pescoço com VPHs integrados, o que realça o potencial da nanomedicina no tratamento do cancro. Embora seja necessária mais investigação, até uma possível aplicação em doentes, este trabalho fornece informações sobre potenciais novas estratégias de direcionamento e moléculas terapêuticas.
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