Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/4769
Título: Development of new antiepileptic drug candidates: a set of lamotrigine-related compounds
Autor: Matias, Mariana Ruivo
Orientador: Alves, Gilberto Lourenço
Silvestre, Samuel Martins
Ferreira, Amílcar Celta Falcão Ramos
Palavras-chave: Epilepsia - Fármacos
Fármacos antipiléticos - Investigação
Fármacos antipiléticos - Toxicidade
Farmacocinética - Fármacos antipiléticos
Data de Defesa: Fev-2018
Resumo: Epilepsy is one of the most common, chronic and serious neurological disorder, affecting million people worldwide. This brain disorder is characterised by recurrent spontaneous seizures, which have a considerable impact in the patients’ quality of life. The pharmacological therapy has been, and is likely to remain, the mainstay of treatment for this disorder. Although a large number of new antiepileptic drugs (AEDs) has been introduced into the market in the last years, about 30-40% of epileptic patients are still inadequately controlled by standard drug therapy. For this reason, it continues to be important to develop new and improved chemical entities through which epilepsy could be effectively controlled. In this context, the main objective of the present work was to discover new lead compounds with anticonvulsant properties for further development as AEDs. To achieve this goal, fifty dihydropyrimidin(thi)ones [DHPM(t)s] were synthesized through the Biginelli reaction, which consists in a one-pot cyclocondensation reaction among an aldehyde, a β-ketoester/acetylacetone and urea or thiourea. The products were purified and characterised by infrared and 1H- and 13C-nuclear magnetic resonance spectroscopy. High resolution mass spectrum was also obtained for the novel compounds. Afterwards, the anticonvulsant activity of the compounds was evaluated against electrically [maximal electroshock seizure (MES) test] and chemically [subcutaneous pentylenetetrazole (scPTZ) test] induced seizures in rodent models. The initial anticonvulsant screening was performed in CD-1 mice (n = 4/group) at 30 min and 4 h after the intraperitoneal administration of 30, 100 and 300 mg/kg of each compound. The investigated compounds were also evaluated in mice for neuromotor impairment (as a surrogate of minimal neurological deficit) on the rotarod performance test. Then, selected compounds previously identified as anticonvulsants in mice at the minimum dose tested were further assessed in Wistar rats (n = 4/group) at 30 min, 2 h and 4 h after the oral administration of 30 mg/kg. Additionally, the fifty DHPM(t)s were evaluated for their in vitro cytotoxicity in rat mesencephalic dopaminergic (N27), human hepatocellular carcinoma (HepaRG), human colorectal adenocarcinoma (Caco-2) and normal human dermal fibroblasts (NHDF) cell lines, through the well-established 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay at the concentration of 30 μM. Moreover, as the efficacy of a molecule is strongly dependent on its pharmacokinetics, several kinetic properties were also investigated in in vitro and in silico models. Thus, all compounds were subjected to a set of in vitro screening assays performed on a cell line overexpressing the drug efflux transporter P-glycoprotein (MDCK-MDR1 cells) and on two models of parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) preditive of the apparent permeability (Papp) through intestinal membrane (intestinal PAMPA model) and blood-brain barrier (PAMPA-BBB model). Lastly, several physicochemical properties of the compounds were also calculated in silico and a set of pharmacokinetic and toxicity properties were estimated employing the new computational tool, pkCSM. The target molecules that were synthesized were mainly selected based on the structure of clinically relevant AEDs, in particular the structure of lamotrigine, aiming to discover new candidates for the development of improved AEDs. The majority of the chemical reactions occurred fastly and the products were obtained in good yields. The synthetic procedure used was also extended using additional specific reagents, being the respective products, which are new to the best of our knowledge, successfully synthesized. Due to practical considerations, only forty-two compounds (twenty-eight urea derivatives and fourteen thiourea derivatives) proceeded to in vivo experiments. The results of the initial pharmacological screening in mice revealed anticonvulsant protection in the MES model for twenty-four compounds showed anticonvulsant protection in the MES model, being nine of them active at the lowest dose tested (30 mg/kg). Structurally, the most promising compounds present smaller chains at the C5 of the dihydropyrimidine ring and an unsubstituted phenyl or a para-tolyl ring at the C4. In addition, the thiourea analogues also presented slightly increased anticonvulsant activity comparing with the corresponding urea analogues. The results of the minimal neuromotor impairment obtained through the rotarod assay showed that approximately 52% of the compounds are less toxic than lamotrigine, carbamazepine and phenytoin. Compounds MM 17, MM 19 and MM 83 also protected against MES-induced seizures in 50-75% of rats after the oral administration of 30 mg/kg. Furthermore, the most active compounds did not show notable cytotoxicity in in vitro experiments conducted in the several cell lines (relative cell proliferation higher than 50% at 30 μM), which can be relevant due to the fact that the toxicity is a common problem of the available AEDs. The data obtained showed that 82% of the investigated compounds are expected to have good intestinal permeability (Papp > 1.1×10-6 cm/s), and 66% of which good brain penetration (Papp > 2.0×10-6 cm/s), which can suggest a high passive transcellular permeability. In both cases, thiourea derivatives presented higher permeability values than the respective urea analogues, which can be associated with their higher lipophilicity. This finding can explain, at least in part, the higher activity of the thiourea derivatives in the anticonvulsant screening after both intraperitoneal and oral administrations. In addition, 44% of the compounds did not significantly modulate (inhibit or induce) P-glycoprotein at 10 and 50 μM. This is an interesting finding since P-glycoprotein is physiologically expressed in several tissues and organs relevant from a pharmacokinetics perspetive. Finally, in silico studies indicated that all compounds respect the Lipinski’s rule-of-five, suggesting that they possess favourable properties that fulfil the druglikeness criteria. The pkCSM in silico tool also estimated that the DHPM(t)s have good human intestinal absorption (67.73-93.91%) and an apparent volume of distribution at the steady-state in the same range of values of the AEDs. The in silico predictions also suggested a low plasma protein binding percentage for the target compounds, which is considered to be therapeutically favourable, minimizing the risk of drug interactions. These results corroborate those obtained with the intestinal PAMPA assay that showed that probably none of the tested compounds have a binding to plasma proteins higher than 90% (Papp ≤ 1.0×10−5 cm/s). The thiourea derivatives were also predicted as compounds that permeate better through biological barriers (e.g., Caco-2 cell monolayers and blood-brain barrier), similarly to the observed in the experimental PAMPA assays. However, the prediction model suggested that 14% of the urea derivatives have tendency for cytochrome P450 inhibition versus 36% of the thiourea derivatives. On the other hand, concerns on the disruption of normal liver function were predicted for half of the compounds. Overall, the set of studies carried out provide new information about the anticonvulsant activity of this class of heterocycles, along with pharmacokinetic and toxicity data. More than half of the investigated molecules showed anticonvulsant protection against electrically-induced seizures (MES model), confirming the interest of the pharmacophoric model for the design of new anticonvulsant agents. The data gathered here allowed to identify important structural features of this attractive scaffold that can be responsible for the anticonvulsant activity, which should be maintained or better explored in order to produce more active analogues in further hit-to-lead optimization. However, the results presented in this thesis are just the “tip of the iceberg” in the discovery and development of the DHPM(t)s as potential AEDs.
A epilepsia é uma perturbação neurológica crónica que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Esta perturbação é caracterizada por crises epiléticas espontâneas e recorrentes, muito variadas na sua origem e apresentação clínica, as quais têm um impacto significativo na qualidade de vida dos doentes. A farmacoterapia tem sido, e provavelmente continuará a ser, o pilar da terapia da epilepsia. Todavia, embora um número considerável de novos fármacos antiepiléticos tenha sido introduzido no mercado nos últimos anos, cerca de 30-40% dos doentes epiléticos não alcançam um controlo apropriado das suas crises, mesmo quando são adequadamente tratados com os fármacos antiepiléticos disponíveis atualmente. Por esta razão, a descoberta e desenvolvimento de novas possibilidades farmacoterapêuticas que sejam mais seguras e, principalmente, mais eficazes, constituem um desafio e são de extrema importância. É neste contexto que surge o principal objetivo do presente trabalho; descobrir novos compostos com propriedades anticonvulsivantes para posterior desenvolvimento de novos fármacos antiepiléticos. Para atingir este objetivo, o design dos compostos selecionados baseou-se essencialmente na estrutura química da lamotrigina e levou à síntese de cinquenta dihidropirimidinonas/dihidropirimidinationas [DHPM(t)s] através da reação de Biginelli, a qual consiste numa reação de ciclocondensação entre um aldeído, um β-cetoester/acetilacetona e ureia ou tioureia. Depois de sintetizados, todos os compostos foram purificados e caracterizados através de espetros de infravermelhos e de ressonância magnética nuclear (protão e carbono-13); espetros de massa de alta resolução também foram obtidos para os compostos novos, ou seja, aqueles que não se encontravam descritos. Posteriormente, a atividade anticonvulsivante dos compostos foi avaliada em modelos animais de crises agudas induzidas eletricamente [teste do eletrochoque máximo (MES)] e quimicamente [teste do pentilenotetrazole subcutâneo (scPTZ)]. O screening inicial da atividade anticonvulsivante foi realizado em murganhos CD-1 (n = 4/grupo) e os compostos foram avaliados aos 30 min e às 4 h após a sua administração intraperitoneal nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg. Paralelamente, os compostos em investigação também foram avaliados em murganhos, quanto à sua toxicidade neuromotora (traduzida pelo deficit neurológico mínimo), através do teste do aparelho rotativo. Posteriormente, alguns dos compostos identificados previamente como anticonvulsivantes nos murganhos na mínima dose testada foram ainda selecionados e testados em ratos Wistar (n = 4/grupo) aos 30 min, 2 h e 4 h após administração oral de uma dose de 30 mg/kg. Adicionalmente, as cinquenta DHPM(t)s foram avaliadas relativamente à sua citotoxicidade em sistemas in vitro de linhas celulares, concretamente em células dopaminérgicas mesencefálicas de rato (N27), células de carcinoma hepatocelular humano (HepaRG), células de adenocarcinoma coloretal humano (Caco-2) e fibroblastos normais da derme humana (NHDF), através do ensaio bem estabelecido do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e a uma concentração de 30 μM. Além disso, como a eficácia de uma molécula está fortemente dependente da sua farmacocinética, várias propriedades cinéticas também foram investigadas em modelos in vitro e in silico. Assim, todos os compostos sintetizados foram sujeitos a um conjunto de ensaios de screening in vitro realizados numa linha celular que sob-expressa o transportador de efluxo glicoproteína-P (células MDCK-MDR1) e em dois modelos de ensaios de permeabilidade em membrana artificial paralela (PAMPA), preditivos da permeabilidade aparente dos compostos através da membrana intestinal (PAMPA intestinal) e da barreira hematoencefálica (PAMPA-BBB). Por último, diversas propriedades físico-químicas dos compostos também foram calculadas in silico e um conjunto de propriedades farmacocinéticas e de toxicidade foram estimados com a uma nova ferramenta computacional, pkCSM. As moléculas alvo sintetizadas foram selecionadas principalmente com base na estrutura de fármacos antiepiléticos clinicamente relevantes, em particular a estrutura da lamotrigina, com o objetivo de descobrir novos candidatos para o desenvolvimento de fármacos antiepiléticos melhorados. A maioria das reações químicas ocorreram rapidamente e obtiveram-se bons rendimentos (acima de 60-70%) para grande parte dos produtos sintetizados. O procedimento de síntese química utilizado foi estendido também a reagentes específicos adicionais, tendo sido sintetizados com sucesso os produtos respetivos, os quais são novos (não descritos na literatura). Devido a questões práticas (baixos rendimentos na sua obtenção e fraca solubilidade aquosa), apenas quarenta e dois compostos (vinte e oito derivados de ureia e catorze derivados de tioureia) prosseguiram para os estudos in vivo. Os modelos animais usados foram os modelos gold standard para a identificação de novos compostos com propriedades anticonvulsivantes, sendo, desta forma, os modelos melhor validados. Os resultados do screening farmacológico inicial em murganhos revelaram proteção anticonvulsivante no modelo MES para vinte e quatro compostos, sendo nove deles ativos na dose mais baixa testada (30 mg/kg). Em termos estruturais, os compostos mais promissores apresentam cadeias mais curtas (provenientes da acetilacetona ou do acetoacetato de metilo) e um anel aromático não substituído ou substituído na posição para com um grupo metilo ligados, respetivamente, ao C5 e ao C4 do anel dihidropirimidínico. Referir também que os derivados tioureia apresentaram uma atividade anticonvulsivante ligeiramente superior comparativamente aos análogos correspondentes da série ureia. Os resultados de toxicidade neuromotora obtidos através do teste do aparelho rotativo evidenciaram que aproximadamente 52% dos compostos são menos tóxicos que a lamotrigina, carbamazepina e fenitoína. Os compostos MM 17, MM 19 (derivados de ureia) e MM 83 (derivado de tioureia) também protegeram contra as crises induzidas pelo MES em 50-75% dos ratos após administração oral (gavage) na dose de 30 mg/kg. Para além da atividade anticonvulsivante, os compostos mais ativos não exibiram citotoxicidade marcada nos estudos in vitro realizados nas diversas linhas celulares (proliferação celular relativa superior a 50% a 30 μM), o que pode ser relevante devido ao facto da toxicidade ser um problema comum aos fármacos antiepiléticos disponíveis. Neste contexto, as células N27 foram utilizadas por serem células neuronais e os alvos de ação dos fármacos antiepiléticos estarem localizados no sistema nervoso central. Por outro lado, procedeu-se à avaliação da citotoxicidade em células hepáticas (HepaRG) e intestinais (Caco-2), respetivamente, porque alguns fármacos antiepiléticos têm sido associados a hepatotoxicidade severa e porque a via oral é a via de administração desejada. Como estas duas linhas celulares são cancerígenas, considerou-se incluir também uma linha celular humana não cancerígena (NHDF). Relativamente aos estudos farmacocinéticos, os dados obtidos mostraram que 82% dos compostos investigados devem apresentar boa permeabilidade intestinal (Papp > 1,1×10-6 cm/s), 66% dos quais poderão ter boa penetração cerebral (Papp > 2,0×10-6 cm/s), o que pode sugerir uma elevada permeabilidade passiva transcelular passiva. Em ambos os ensaios, os derivados tioureia apresentaram valores de permeabilidade superiores em relação aos respetivos análogos da série ureia, o que pode estar associado à sua natureza mais lipofílica. Estes resultados podem explicar, pelo menos em parte, a maior atividade observada para os derivados tioureia no screening anticonvulsivante após as administrações por via intraperitoneal e via oral. Notar também que 44% dos compostos não modularam significativamente a glicoproteína-P (por inibição ou indução) a 10 μM e 50 μM. Este foi um achado importante porque a glicoproteína-P está fisiologicamente expressa em vários tecidos e órgãos relevantes de um ponto de vista farmacocinético. Finalmente, os estudos in silico indicaram que todos os compostos respeitam a regra dos cinco de Lipinski, sugerindo que eles possuem propriedades intrínsecas favoráveis de forma a preencher os critérios de druglikeness. A ferramenta in silico pkCSM também estimou que as DHPM(t)s têm boa absorção intestinal no homem (67,73-93,91%) e um volume aparente de distribuição no estado estacionário na mesma gama de valores encontrados para os fármacos antiepiléticos. As predições in silico também sugeriram uma percentagem baixa de ligação às proteínas plasmáticas para os compostos em estudo, o que é considerado favorável terapeuticamente, minimizando-se assim o risco de interações. Estes resultados corroboram os resultados obtidos no ensaio de PAMPA intestinal que mostrou que provavelmente nenhum dos compostos testados têm uma ligação às proteínas plasmáticas superior a 90% (Papp ≤ 1,0×10−5 cm/s). Os derivados tioureia foram ainda considerados como os compostos que permeiam melhor através de barreiras biológicas (p.e., em monocamadas de células Caco-2 e barreira hematoencefálica), de modo similar ao obtido nos estudos experimentais de PAMPA. Contudo, o modelo preditivo utilizado sugeriu que 14% dos derivados ureia têm tendência para inibir o citocromo P450 versus 36% dos derivados tioureia. Por outro lado, preocupações com a disrupção da função hepática normal foram preditas para metade dos compostos. Globalmente, os estudos levados a cabo fornecem novas informações sobre a atividade anticonvulsivante desta classe de heterociclos, bem como dados farmacocinéticos e de toxicidade. Mais de metade das moléculas investigadas apresentaram proteção anticonvulsivante contra as crises induzidas eletricamente (no modelo do MES), confirmando o interesse do modelo farmacofórico para o design de novos agentes anticonvulsivantes. Os dados aqui reunidos permitiram a identificação de características estruturais importantes destas moléculas que podem ser responsáveis pela atividade anticonvulsivante, as quais devem ser mantidas ou melhor exploradas para produzir análogos mais ativos nos próximos passos do desenvolvimento destes candidatos a fármacos. No entanto, os resultados apresentados nesta tese constituem apenas a “ponta do iceberg” no que diz respeito à descoberta e desenvolvimento de DHPM(t)s como potenciais fármacos antiepiléticos.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/4769
Designação: Doutaramento em Ciências Farmacêuticas
Aparece nas colecções:FCS - DCM | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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