Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/5671
Título: Establishment of a method to evaluate the plasticity and maturation of the dopaminergic nerve terminal
Autor: Neto, Diogo António Bessa
Orientador: Almeida, Ramiro Daniel Carvalho de
Baltazar, Graça Maria Fernandes
Palavras-chave: Câmaras Microfluídicas
Cromatografia Líquida de Alta Performance (Hplc)
Dopamina (da)
Mesencéfalo
Sinapse
Data de Defesa: 31-Out-2014
Resumo: The modulatory midbrain dopamine (DA)ergic system is involved in important functions such as control of voluntary movement, reinforcement, learning and state of mind. Moreover, it is directly associated with some of most studied neuropathologies like Parkinson’s disease, Huntington’s disease and schizophrenia, and also drug addiction. Together, these functions/associations make the DAergic system an appealing field of study in neuroscience. Neurotransmission occurs predominantly through chemical synapses and is already well studied for glutamatergic hippocampal neurons. Nevertheless, DAergic transmission is still poorly investigated and many questions remain about how DA is transmitted. Embrionary ventral midbrain cultures are poor in DAergic neurons and current culture techniques inadequate to conduct axonal studies in these impoverished cultures. Thus, we tried to implement a microfluidic culture device that allows the physical and fluidic axonal isolation from somatodendritic ‘contamination’, with the help of glial cell line-derived neurotrophic factor supplementation to improve the DAergic survival. We showed that cells were maintained viable in microfluidic chambers for at least 14 days in culture, however, the number of DAergic axons was still low, not only due to the culture method limitations but also due to more broad problems associated with the cell cultures which occurred at same time. In addition, we optimized the detection of monoamine neurotransmitters and their metabolites present in embrionary ventral midbrain cultures by high-performance liquid chromatography coupled to electrochemical detection. In our cultures, only DA was detected, and was drastically reduced when cells were stimulated by the DAergic toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+). While the number of labelled cells for tyrosine hydroxylase was not affected by MPP+, at the concentrations tested.
O sistema dopamina (DA)érgico do mesencéfalo é composto por três principais grupos de neurónios DAérgicos: substantia nigra, área tegmental ventral e núcleos accumbens. Ainda que apenas uma pequena parte do nosso cérebro, este sistema encontra-se envolvido em algumas funções importantes no nosso dia-a-dia tal como é o caso do controlo voluntário dos movimentos, excitação, aprendizagem e estado psicológico. Além disso, este encontra-se diretamente associado com algumas das neuropatologias mais estudadas atualmente tal como a doença de Parkinson, a doença de Huntington e a esquizofrenia, tendo mais recentemente sido associado à dependência das drogas de abuso. Assim, devido às funções mediadas e também à sua associação com as patologias mencionadas, o sistema DAérgico tornou-se um alvo de grande interesse para as neurociências. A transmissão de informação entre neurónios dá-se principalmente através da formação de sinapses químicas. Estas sinapses são geralmente descritas como duas regiões especializadas na transmissão e receção de informação, respetivamente, a membrana pré- e pós-sináptica, separadas por um micro espaço designado de fenda sináptica onde ocorre a transmissão da informação. A transmissão nestas sinapses é comummente descrita como sendo direta, ou seja, encontra-se limitada à região da fenda sináptica. Contudo, alguns estudos têm tentado provar que tal tipo de transmissão não é totalmente verdade para as sinapses DAérgicas. No entanto, este tipo de sinapses é ainda relativamente pouco estudada e muitas questões mantém-se por esclarecer. Uma metodologia bastante usada para se estudar os neurónios DAérgicos é através de culturas embrionárias do mesencéfalo ventral, contudo a percentagem de células positivas para o marcador DAérgico tirosina hidroxilase (TH) neste tipo de culturas é muito baixo, dificultando grande parte dos estudos deste tipo de células. Assim neste trabalho testámos algumas condições que foram já demonstradas como tendo a capacidade de melhorar a sobrevivência deste tipo de neurónios. Nas nossas culturas, as três condições testadas aumentaram individualmente em aproximadamente 70% a sobrevivência de células positivas para a TH em relação ao controlo. Não havendo uma condição que resultasse em melhores resultados relativamente às restantes, escolhemos a suplementação da cultura pelo fator neurotrófico derivado de uma linha de células da glial (GDNF) para realizar o nosso trabalho por questões de facilidade na utilização e rentabilização de tempo. Por outro lado, os estudos encontrados em culturas de mesencéfalo ventral recorreram a técnicas com algumas limitações para o estudo de terminais axonais e a formação sináptica nessa região. Assim, o intuito deste trabalho consistiu na tentativa de implementação de um novo método, câmaras microfluídicas, para se estudar este tipo de estruturas. Uma metodologia que já foi implementada com sucesso a vários tipos de cultura como neurónios hipocampais, corticais e dos gânglios da raiz dorsal. Estas câmaras microfluídicas consistem num polímero biocompatível com ranhuras impressas, designado geralmente por PDMS, fixado contra uma lamela de vidro, da qual resultam dois compartimentos interligados por um conjunto de microcanais. Para atingir o fim aqui proposto, vários parâmetros foram estudados: tempo em cultura, densidade celular e comprimento dos microcanais das câmaras. Verificámos que neste tipo de sistema as células se mantiveram viáveis até ao 14º dia em cultura. Contudo, em termos de isolamento axonal DAérgico nenhuma das condições testadas foi capaz de produzir condições favoráveis para a implementação do método. No entanto, é necessário destacar que os resultados podem também ter sido afetados por problemas mais abrangentes que ocorreram nas culturas celulares e que certamente comprometeram os resultados. Em paralelo com o trabalho acima descrito, também a otimização da quantificação de neurotransmissores e seus metabolitos em lisados de culturas do mesencéfalo ventral foi realizado. Nós verificamos que nas nossas culturas, dos compostos testados, apenas a DA foi detetada por cromatografia líquida de alta-performance (HPLC). Além disso, quando estimuladas com a toxina DAérgica MPP+, os níveis intercelulares de DA diminuíram abruptamente. Enquanto recorrendo à marcação contra a TH, nenhuma diferença foi verificada. Assim, a quantificação dos níveis de DA aparenta ser uma técnica muito mais sensível para avaliar o efeito de uma lesão em culturas embrionários do mesencéfalo ventral do que a marcação contra a TH por imunocitoquímica.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/5671
Designação: 2º Ciclo em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:FCS - DCM | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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